Исследование тимопоэза у детей с тимомегалией с помощью определения тимусных эксцизионных колец

Полный текст

У детей (особенно в возрасте до 3-5 лет) нередко наблюдается увеличение размеров вилочковой железы (тимуса). В отечественной литературе подобное состояние определяется как тимомегалия. Некоторые исследователи рассматривают увеличение размеров тимуса у детей как возможный вариант нормы. Однако в большей части работ у детей с тимомегалией, кроме отягощенного анамнеза, выявлены различные иммунологические и гормональные нарушения [1-4]. Значительная распространенность увеличения вилочковой железы у детей вызывает повышенный интерес к данной проблеме не только педиатров, но и других специалистов. Тимус является основным органом лимфопоэза у человека. В нем созревают, проходят селекцию и диф- ференцировку Т-лимфоциты. Т-клетки, недавние мигранты из тимуса, несут так называемые Т-рецепторные эксцизионные кольца (ТРЭК - T-cell receptor excision circle) - следы недавно произошедшей перестройки генов Т-клеточного рецептора - TCR [5-7]. Так называют кольцевые молекулярные структуры, образующиеся в процессе реаранжировки V- генов в результате замыкания в кольцо участков ДНК, вырезаемых из зародышевых V-генов [5]. Различают сигнальные и кодирующие эксцизионные кольца, которые образуются соответственно при реаранжировке гена 5- и a-цепей (ген TRDV локализован внутри кластера TRAV и может подвергаться перестройке дважды - при построении зрелых генов TRDV и TRAV). Эти кольца находятся в Т-клетках некоторое время после их выхода из тимуса и служат маркером «недавних тимических мигрантов». Клетки, содержащие ТРЭК, обладают функцией Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Однако их функциональная активность выражена слабее, чем у аналогичных клеток периферического отдела иммунной системы (например, они слабее секретируют IL-2 и IFN-y в условиях активации). Данные об изменении численности «недавних мигрантов из тимуса» рассматриваются как показатели функции тимуса и являются на сегодняшний день единственным непосредственным методом оценки тимического развития Т-лимфоцитов [8]. Эти структуры определяются с помощью ПЦР. В настоящее время основными патологическими состояниями, при которых исследование уровня ТРЭК на клиническом уровне стало реальностью, являются первичные Т-клеточные иммунодефициты [9]. В нашей работе мы попытались оценить функциональное состояние тимуса с помощью определения ТРЭК у детей с тимомегалией методом ПЦР в реальном времени. Уровень ТРЭК в лимфоцитах периферической крови пациентов с тимомегалией в сравнении с лицами без увеличения тимуса Возраст, годы Лица с тимомегалией Лица без тимомегалии число обследованных ТРЭК, копий на 1000 лимфоцитов число обследованных ТРЭК, копий на 1000 лимфоцитов До 2 30 29,62*(18,19-41,09) 10 73,34 (53,99-83,84) 2-10 13 8,90* (4,82-14,16) 36 16,37 (8,65-36,38) 11-18 4 2,17 (1,64-3,51) 17 5,02 (2,59-5,91) 40 11 3,39 (0,74-5,21) [14] 1 0,01 Примечание.* - p < 0,05 в сравнении с контрольной группой. Материал и методы Уровень ТРЭК определяли у 47 детей с тимомегалией в возрасте от 1,5 мес до 18 лет (также обследован 1 человек 40-летнего возраста). Большинство детей с тимомегалией были в возрасте до 5 лет (42 ребенка). Больные находились на стационарном лечении в Моро- зовской детской городской клинической больнице. У 23 детей в возрасте до 2 лет диагностирован острый простой/об- структивный бронхит, материал для исследования был взят при поступлении в стационар до начала лечения. Остальные пациенты были из группы часто болеющих детей. Число ТРЭК определяли также у 53 детей без тимомегалии (группа сравнения), из них у 9 детей в возрасте до 2 лет диагностирован бронхит. У детей с тимомегалией размер тимуса определяли рентгенологически. Мерой выраженности тимомега- лии был кардио-тимико-торакальный индекс (КТТИ), который определяли по отношению ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы. В исследование отобраны дети с тимомегалией II степени (0,37 < КТТИ < 0,42). до 10 лет до 20 лет Возраст Рис. 1. Возрастные различия уровня ТРЭК у здоровых и лиц с тимомегалией. * - p<0,05. Тимомегалия -•-Здоровые лица Из венозной крови обследованных детей выделяли мононуклеары периферической крови с помощью центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин («Sigma»). Из 1 • 106 моно- нуклеаров выделяли ДНК с использованием набора «Проба НК» («ДНК-Технология»). Для проведения ПЦР применяли набор TaqMan Universal PCR Master Mix Reagents Kit («Applied Biosystems»). Для определения ТРЭК (сигнальных эксцизионных колец) использованы праймеры: прямой 5’-CGTGAGAACGGTGAATGA AGA GCAGACA-3’, обратный 5 ’ -C ATCCCTTTC AACC A TGCTGACACCTCT-3’, зонд 5 ’ -FAM-TTTTT GTAA AGGTGCCCACTCCTGTGCACGGTGA-MGB-3’ («Син- тол») [10]. ПЦР ставили в объеме 25 мкл на приборе «7300 Applied Biosystems Real-time PCR System». Программа амплификации: 1 цикл - 50 °С в течение 2 мин, 95°С 10 мин; 50 циклов - 94°С 30 с, 60°С в течение 1 мин. Расчет числа копий ТРЭК проводили с использованием стандартной кривой, построенной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Плазмида получена путем клонирования ДНК ТРЭК тимоци- тов человека в вектор pJet1.2/Blunt («Fermentas»). Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1000 лимфоцитов. Статистическую обработку проводили методами непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (LQ-UQ), где Ме - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль. Для сравнения двух независимых выборок по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при p<0,05. Результаты и обсуждение Ранее нами было показано, что при тимомегалии у детей отмечаются Т-лимфопения, затрагивающая в основном CD4+-клетки, а также ослабление активации Т-клеток [4, 11-13]. Поскольку увеличение размера тимуса неизбежно сочетается с нарастанием числа тимо- цитов, можно констатировать, что это нарастание парадоксальным образом связано с уменьшением количества Т-клеток на периферии и снижением их функциональных потенций. Уменьшение количества Т-клеток на периферии может быть результатом сдвига баланса прироста их числа, обусловленного притоком Т-клеток из тимуса и их пролиферацией на периферии, и убыли клеток, связанной с их гибелью. Ни спонтанная пролиферация, ни спонтанный апоптоз Т-клеток у детей с тимомегалией не изменены [13]. Остается допустить возможность ослабленной эмиграции Т-клеток из тимуса, роль которой в становлении популяции Т-лимфоцитов в детском возрасте весьма существенна. В нашей работе мы провели исследование эмиграции Т-клеток из тимуса. В таблице представлены данные о содержании ТРЭК в лимфоцитах крови пациентов с тимомегалией в сравнении с таковым у лиц без увеличения тимуса (обследован 1 человек 40-летнего возраста, группа сравнения для него взята из нашей предыдущей статьи [14]). Оценка содержания ТРЭК в лимфоцитах крови детей с тимомегалией в возрасте до 2 лет и детей без тимомега- лии той же возрастной группы показала, что при тимоме- галии число копий ТРЭК в пересчете на 1000 лимфоцитов снижено в 2,5 раза - 29,6 (18,1-41,0) копии против 73,3 (54,0-83,8) копии в контроле (см. таблицу). Наблюдаемые различия высокодостоверны (д=0,001). При сопоставлении числа копий ТРЭК у детей до 2 лет с тимоме- галией с показателями возрастной нормы, отраженными на рис. 1, оказалось, что они соответствуют нормальным показателям, свойственным примерно 8-летним детям, у которых функциональная активность тимуса снижена по сравнению с детьми более раннего возраста. В дальнейшем (после 2 лет) разница в уровне ТРЭК у детей с тимомегалией в сравнении с детьми без увеличения тимуса менее выражена: в возрасте до 10 лет она составляет 1,8 раза. Тимомегалия у лиц старшего возраста - довольно редкая патология; тем не менее обследование единственного пациента 40 лет с тимомегалией показало практически полное отсутствие в клетках его крови ТРЭК (0,01 копии на 1000 клеток), что значительно ниже возрастной нормы (3,39 копии/тыс. клеток [14]). Пример прохождения ПЦР в реальном времени для оценки содержания ТРЭК в лимфоцитах крови здорового ребенка и ребенка с тимомегалией приведен на рис. 2. Ранее нами показано, что среди иммунологических отклонений, зарегистрированных у детей с тимомега- лией, наиболее постоянно проявляется Т-лимфопения с преобладающим снижением содержания CD4+-лимфоцитов, уровня пролиферативного ответа Т-клеток на митоген [13]. Кроме того, в предыдущих работах нами выявлено снижение содержания естественных регуляторных CD4+CD25hi-Т-клеток и их основного внутриклеточного маркера FохP3, а также усиление экспрессии генов супрессорных цитокинов TGF-P, IL-10 и IL-6 [15]. В этих работах нами высказано предположение, что снижение содержания T-лимфоцитов и их субпопуляций в крови детей раннего возраста с тимомегалией обусловлено общим ослаблением продуктивного Т-лимфопоэза. В настоящей работе мы нашли подтверждение этому факту: нами получены прямые свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей с тимомегалией, т. е. ослабления у них процессов Т-лимфопоэза в тимусе. Delta Rn vs Cycle Cycle Number Рис. 2. Пример прохождения ПЦР для оценки содержания ТРЭК в лимфоцитах крови здорового ребенка и ребенка с тимомегалией одинакового возраста. Представлены кривые накопления продуктов амплификации (в дублях): 1 - ДНК ТРЭК здорового ребенка; 2 - ДНК ТРЭК ребенка с тимомегалией; 3 - ДНК стандартов (107, 106, 105, 104, l03, 102, 101 копий/мкл). По оси абсцисс - номер цикла ПЦР; по оси ординат - Delta Rn (различие между значением Rn (нормированной репортерной флюоресценции) для реакционной смеси и фоновой флюоресценцией). В данной работе мы не касались вопроса о клинической значимости увеличения размеров тимуса. Тем не менее возникает вопрос о том, могут ли изменения иммунологических показателей, наблюдавшиеся у детей с тимо- мегалией, стать причиной иммунодефицита, имеющего клинически значимые последствия. В нашей работе показано, что у детей с тимомегалией имеет место ослабление выхода зрелых Т-клеток из тимуса, что, по-видимому, приводит к Т-лимфопении (в основном за счет снижения содержания CD4+-Т-клеток), с некоторым ослаблением уровня пролиферативного ответа на мито- ген, и эндогенной активации Т-клеток [13]. Эти изменения вызывают функциональный дефицит Т-клеточного звена иммунной системы и могут способствовать проявлению ее несостоятельности. Поэтому детей с тимомега- лией следует рассматривать как детей из группы риска, предрасположенных к более частому возникновению заболеваний. Ослабление эмиграции Т-лимфоцитов при тимомегалии может также стать причиной усиления гомеостатической пролиферации, которая может исказить структуру популяции периферических Т-лимфоцитов и привести к нежелательным последствиям (например, таким, как аутоиммунная патология) в отдаленные сроки.

Об авторах

Альмира Дмитриевна Донецкова

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Email: almira_donetskova@yahoo.com
доктор мед.наук, старший научный сотрудник лаборатории дифференцировки лимфоцитов 115478, Москва, Россия

П. Д Ваганов

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, Москва, Россия

М. Ф Никонова

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

115478, Москва, Россия

Э. Ю Яновская

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, Москва, Россия

Э. Т Манджиева

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, Москва, Россия

Е. М Родионова

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, Москва, Россия

И. М Донин

ГБУЗ «Морозовская ДГКБ ДЗМ»

119049, Москва, Россия

М. А Пушкарев

ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, Москва, Россия

А. А Ярилин

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

115478, Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы