COMPARATIVE EVALUATION OF BONE TISSUE REGENERATION WITH LIMITED DEFECTS OF THE PARIETAL BONE (EXPERIMENTAL STUDY ON ANIMAL MODELS)

Full Text

Введение Репаративный остеогенез является общебиологическим процессом регенерации тканей и проявляется стереотипной воспалительно-репаративной реакцией [1]. Основой полноценного процесса репарации является наличие всех компонентов триады тканевой регенерации: матрицы, клеток, способных к формированию желаемого фенотипа, и сигнальных молекул. Последние представлены в виде факторов роста и цитокинов, рецепторы к которым экспрессируются на мембранах клеток в линейной прогрессии от незрелых предшественников к высокодифференцированным клеткам. Морфогенетические белки и факторы роста на определённом этапе включаются в процесс регенерации, однако продолжительность действия, необходимая концентрация и принцип их взаимодействия окончательно не изучены [2]. Наиболее известными факторами роста являются PDGF, TGF-β, IGF, VEGF, bFGF, EGF, которые содержатся в α-гранулах цитоплазмы тромбоцитов. Факторы роста получают из цельной крови путём центрифугирования, фракционирования и последующей активации тромбоцитов, в результате выделяют плазму, богатую факторами роста (plasma rich in growth factors - PRGF) и обладающую мощными индуцирующими свойствами [3]. Согласно данным периодической литературы, результаты гистологических исследований, полученные в ходе экспериментальных работ с животными, показывают, что заполнения дефекта зрелой костной тканью не происходит. Некоторые авторы отмечают, что при использовании синтетических костных материалов костеобразование происходит по периметру препарата, непосредственно в области, заполненной синтетическим материалом, остеогенеза не происходит [4]. Другие исследователи обращают внимание на отсутствие формирования полноценного костного регенерата вследствие инкапсуляции частиц материала [5, 6] либо полной или частичной их резорбции [7]. В результате в большинстве случаев выявляется неоконченная регенерация, которая наиболее выражена при больших размерах костного дефекта. Необходимо учитывать тот факт, что рост костной ткани возможен по мере резорбции остеопластического материала, а пролонгирование этого процесса непосредственно влияет на качество остеогенеза [8]. Из вышеизложенного следует, что идеального синтетического материала, соответствующего необходимым характеристикам и имеющего в своем составе все компоненты «триады тканевой регенерации», на сегодняшний день не существует [9-14]. Однако существующие на данный момент теоретические предпосылки и данные лабораторных и клинических исследований могут значительно расширить научный подход к решению этой проблемы в виде комплекса мер, направленных на создание материала, обладающего всеми необходимыми свойствами для полноценной регенерации костной ткани [13-21]. Таким образом, проведение сравнительного анализа динамики процесса репаративного остеогенеза на экспериментальных моделях с применением PRGF и остеопластического материала по отдельности и в сочетании - в виде биокомплекса является актуальной и перспективной задачей всей регенеративной медицины в целом и хирургической стоматологии в частности. Цель исследования - изучить особенности влияния плазмы, богатой факторами роста, на репаративный остеогенез костной ткани теменных костей на экспериментальных моделях. Материал и методы Исследование проводилось на базе отдела экспериментальной хирургии НИИ трансляционной медицины и кафедры челюстно-лицевой хирургии и стоматологии СФ ФГБОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам Национального стандарта РФ ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» и согласованы с этическим комитетом при ФГБОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Для выполнения экспериментального исследования использовали 16 кроликов, самцов породы советская шиншилла. Возраст животных к моменту хирургического вмешательства составлял 4-6 мес, масса тела 3500-5000 кг. В зависимости от метода пластики дефекта костной ткани экспериментальные модели были разделены на четыре группы, по четыре кролика в каждой: ◆1-я группа - дефект заполняли кровяным сгустком; ◆2-я группа - дефект заполняли фибриновым гелем PRGF; ◆3-я группа - дефект заполняли материалом Osteobiol Gen-oss; ◆4-я группа - дефект заполняли комплексом Osteobiol Gen-oss и PRGF. В ходе экспериментального исследования группы сформировали следующим образом: 1-я и 3-я группы - контрольные, 2-я и 4-я - группы исследования. В качестве остеопластического материала в 3-й и 4-й группе использовали препарат Osteobiol Gen-oss, который представляет собой гидратизированную и коллагенизированную измельчённую свиную костную ткань. PRGF получали путём центрифугирования крови на роторной центрифуге BTI PRFG Система IV, её использовали во 2-й группе в виде геля, в 4-й группе в виде жидкости. В качестве анестезиологического пособия применяли препарат Золетил 100. Для проведения оперативного вмешательства использовали набор хирургических инструментов, в качестве шовного материала применяли хирургическую нить Vicryl 4-0 и Полиамид 3-0. Хирургическое вмешательство осуществляли под общей анестезией препаратом Золетил 100, 15 мг/кг массы тела животного, вводимым внутримышечно. Животное фиксировали на станке, теменную область освобождали от волосяного покрова и обрабатывали антисептическим раствором. В теменной области по срединной линии скальпелем производили разрез кожи, подкожно-жировой клетчатки, надкостницы, теменную кость скелетировали, обнажали костную ткань. В области теменной кости остеотомом диаметром 6 мм прерывисто на малых оборотах с охлаждением создавали округлый дефект, 7 мм в диаметре и 3 мм в глубину, до внутренней кортикальной пластинки. Дефект заполняли исследуемым материалом, укрывали надкостницей и ушивали узловыми швами хирургической нитью Vicril 4-0. На кожу накладывали узловые швы нитью Полиамид 3-0. Гемостаз производили по ходу операции. Для получения PRGF непосредственно перед оперативным пособием экспериментальным моделям 2-й и 4-й группы производили венепункцию краевой ушной вены, забор крови осуществляли в вакуумные стеклянные пробирки ёмкостью 4,5 мл, содержащие 3,2% цитрата натрия. Центрифугирование крови производили на роторной центрифуге BTI PRFG Система IV 8 мин в режиме 2400 об/мин. После центрифугирования цельная кровь разделялась на три фракции (плазма крови, лейкоцитарная плёнка, эритроцитарная взвесь). Цельная плазма в свою очередь разделялась на три фракции, первые две с низким содержанием тромбоцитов, и плазменная часть с самой высокой концентрацией тромбоцитов (фракция 3). Третью фракцию, богатую тромбоцитами и факторами роста, при помощи дозатора перемещали в одноразовые стеклянные пробирки ёмкостью 4,5 мл, без наполнителя. Полученную PRGF смешивали с 10% раствором CaCl в соотношении 50 мкл:1мл. Далее в пробирку добавляли 0,2 г гранул остеопластического материала, таким образом получали биокомплекс вязко-пластичной консистенции, состоящий из материала Osteobiol Gen-oss и PRGF, который использовали у животных 4-й группы. У животных 2-й группы PRGF использовалась в виде геля. В 3-й группе животных пластику дефекта костной ткани производили материалом Osteobiol Gen-oss, предварительно смешанным с 0,9% раствором натрия хлорида. После наложения швов на операционную рану всем 100% животных внутримышечно вводили раствор антибиотика Байтрил (энрофлоксацин) 5% из расчёта 10 мг/кг. Продолжительность антибактериальной терапии составляла 7 дн. В послеоперационном периоде осмотры животных проводились на 1-е, 3-и, 5-е и 7-е сутки, в дальнейшем - 2 раза в неделю. Животных выводили из опыта на 30-е, 60-е и 90-е сутки эксперимента, подвергая эвтаназии путём передозировки этилового эфира, при этом наступала остановка дыхания и смерть. Для проведения гистологического исследования производили забор участка теменной кости экспериментальной модели в виде блока прямоугольной формы размером 1,5 × 0,5 × 0,5 см, материал помещали в гистологические кассеты размером 40 × 26 × 7 мм и фиксировали в 10% растворе формалина. По окончании фиксации кассеты помещали в корзину гистопроцессора TLP-144, в котором в автоматическом режиме происходило обезвоживание и декальцинация тканей. Заливку препарата производили в заливочном модуле ESD-2800 гранулированной парафиновой средой. После заливки препарат помещали в ротационный автоматический микротом RMD-4000, при помощи которого в ручном режиме производили гистологические срезы толщиной 12-15 мкм. Перед окрашиванием со срезов удаляли парафин при помощи раствора о-ксилола, затем препарат помещали в дистиллированную воду. Окраску микропрепарата проводили при помощи линейного автоматического стейнера ALS-96, в качестве красителей использовали гематоксилин и водный раствор эозина. Заключение срезов под покровные стекла производили аппаратом НСМ 6000, монтирующей средой являлась смесь акриловых смол в ксилоле. Анализ гистологических препаратов производили при помощи микроскопа MEIJI MT 4300 L (Япония) и программного обеспечения Levenhuk ToupView (Китай), гистологические срезы визуализировали при 10-, 40- и 100-кратном увеличении микроскопа. Результаты и обсуждение Послеоперационный период в 100% случаев наблюдений протекал без осложнений. Явления экссудации из послеоперационной раны серозно-сукровичным отделяемым наблюдались 2,6 ± 0,9 дня. Послеоперационный отёк мягких тканей теменной области сохранялся до 3,2 ± 0,7 дня. Послеоперационные раны заживали на 7,1 ± 0,6 дня (см. рисунок на 2-й стр. обложки). В 1-й группе животных репаративный остеогенез происходил в условиях естественной регенерации костной ткани под сгустком крови. При изучении макропрепаратов на 90-е сутки костные дефекты представляли собой воронкообразное углубление диаметром 2,2 ± 0,4 мм и глубиной 1,4 ± 0,4 мм (табл. 1). Согласно данным гистологического исследования, наблюдалась картина фибро- и ангиогенеза, где визуализировались участки соединительной ткани с тонкими, хаотично расположенными коллагеновыми волокнами и новообразованными кровеносными сосудами (см. рисунок, А на 2-й стр. обложки). Клеточный состав соединительной ткани во всех наблюдениях представлен фиброцитами и фибробластами. Грубоволокнистая костная ткань визуализировалась в пристеночных участках дефекта. Выявлены остеоны пластинчатой костной ткани, ориентированные перпендикулярно и вдоль по отношению к дефекту. Просматривались костные пластинки, крупные костные полости и костные канальцы, в составе которых находились остеобласты, остеокласты и единичные макрофаги. В пластинчатой костной ткани, расположенной ближе к центру дефекта, выражены процессы пролиферации, дегенерации (остеомаляция и резорбция) с незначительно выраженным воспалительным инфильтратом, представленным нейтрофильно-макрофагальными клетками. Данную морфологическую картину можно объяснить наличием гранулематозного воспалительного процесса в зоне дефекта, который создавал препятствие процессу остеогенеза (табл. 2). Даже через 90 сут искусственно созданный дефект определялся на фоне здоровой кости. Во 2-й группе животных дефект костной ткани заполняли фибриновым гелем PRGF. Макроскопически на 90-е сутки в области дефекта также определялось воронкообразное углубление диаметром 1,6 ± 0,5 мм и глубиной 1,2 ± 0,3 мм. При микроскопическом исследовании помимо формирования очагов плотной волокнистой соединительной ткани наблюдалась пролиферация хрящевой ткани в виде мелкоочаговых фокусов гиалинового хряща, представленного молодыми и зрелыми хондроцитами и хондробластами, которые формировали изогенные группы клеток и располагались хаотично в соединительной ткани вблизи трабекул (см. рисунок, Б на 2-й стр. обложки). По сравнению с 1-й группой здесь преобладала доля фиброваскулярной ткани. По периферии гиалинового хряща визуализировались вторичные центры окостенения. Выявлены участки омелевшего хряща, которые окружены множеством мелких кровенаполненных сосудов с периваскулярной миграцией остеогенных клеток и клеток мезенхимального происхождения из периоста в область дефекта. Данные клетки активно участвуют в процессе замещения омелевшего хряща новообразованной костной тканью. Остеогенные зоны ориентированы вдоль костного дефекта. Полученная гистологическая картина свидетельствует о положительном эффекте использования фибринового геля PRGF на процесс репарации костной ткани вследствие уменьшения доли клеток воспалительного ряда и ускорения пролиферации клеток и элементов костной ткани. В 3-й группе пластика дефекта производилась гранулами остеопластического материала Osteobiol Gen-oss. На 90-е сутки после хирургического вмешательства в большинстве случаев костный дефект не определялся. При микроскопии наблюдали умеренную гиперплазию волокнистого слоя периоста, со стороны которого происходило прорастание соединительной ткани и кровеносных сосудов в остеопластический материал, что в свою очередь создавало благоприятные условия для оссификации остеопластического материала (см. рисунок, В на 2-й стр. обложки). В участках периоста, прилежащих непосредственно к остеопластическому материалу, определялись гигантские многоядерные клетки типа остеокластов и единичные остеобласты. В большей части дефекта определялся активный процесс замещения незрелой грубоволокнистой костной ткани в зрелую пластинчатую кость, с формированием полостей, заполненных клетками красного костного мозга и ретикулярной ткани. В 4-й группе в качестве остеопластического материала использовали биокомплекс, состоящий из гранул материала Osteobiol Gen-oss и PRGF. На 90-е сутки дефект не определялся. Гистологическая картина указывает на уменьшение интенсивности прорастания соединительной ткани в зоны остеопластического материала по сравнению с таковой у 3-й группы исследования. Количество остеобластов в пери- и эндосте незначительно по сравнению с таковым в других группах исследования, что соответствует завершению процесса ремоделирования грубоволокнистой костной ткани в зрелую пластинчатую костную ткань, которая заполняла основной объём дефекта, также выявлены многочисленные интерстициальные пространства, заполненные клетками гемального и стромального компонента, включающего ретикулярную ткань и сосуды (см. рисунок, Г на 3-й стр. обложки). Можно констатировать, что полного замещения остеопластического материала на момент окончания эксперимента не произошло, тем не менее по сравнению с 3-й группой экспериментальных животных выявлено наиболее выраженное замещение искусственной кости. Описанные изменения соответствуют картине непрямого остеогенеза с резорбцией остеопластического материала и выраженного пролиферативного замещения тканей различного гистогенеза. Заключение На основании сравнительного анализа результатов экспериментального исследования процесса остеогенеза костной ткани теменных костей установлена эффективность использования PRGF в процессе репаративной регенерации кости, что выражалось в уменьшении доли клеток воспалительного ряда, ускорении пролиферации скелетогенных клеток и синтеза элементов костного матрикса. Отмечено сокращение срока ремоделирования грубоволокнистой костной ткани в зрелую пластинчатую кость с активным вовлечением имплантированного остеопластического материала. Сравнительная оценка динамики восстановления костной ткани в 1-й и 2-й группах указывает на эффективность использования PRGF в процессе репаративной регенерации в виде ускорения сроков замещения ограниченных дефектов костной ткани на 30 сут от периода наблюдения. При изучении и сравнительном исследовании репаративного остеогенеза костной ткани теменных костей доказано, что применение плазмы крови, богатой факторами роста, в сочетании с остеопластическими материалами для заполнения ограниченных костных дефектов челюстей является эффективным и перспективным методом устранения ограниченных дефектов костной ткани.

About the authors

Natalia M. Khelminskaya

The N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: khelminskaya@mail.ru
doctor of medical sciences, professor of the Department of Maxillofacial Surgery and Dentistry Dentists’ faculty, Dean of Dentists’ faculty “Nhe N.I. Pirogov Russian National Research Medical University”, 117997, Moscow, Russian Federation 117997, Moscow, Russian Federation

A. P Ettinger

The N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

V. I Kravets

The N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

M. D Polivoda

The N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

A. V Goncharova

The N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

N. M Krasnov

The N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files