THE DECREASE OF EMIGRATION OF T-LYMPHOCYTES FROM THYMUS UNDER THYMOMEGALIA IN CHILDREN OF EARLY AGE

全文:

Термином «тимомегалия» принято обозначать увеличение объема и массы тимуса выше предельных возрастных значений с сохранением нормальной гистоархитектоники органа [5, 7]. Тимомегалия чаще всего определяется у детей раннего возраста. При тимомегалии наблюдаются признаки гипофункции Т-клеточного звена иммунной системы — снижение численности Т-лимфоцитов, изменение их субпопуля-ционного состава, ослабление функциональной активности [1, 4, 6, 8, 9]. Характерным для этого состояния является снижение сывороточного уровня гормонов тимуса [4], свидетельствующее об ослаблении эндокринной функции тимуса. Увеличение численности лимфоидных клеток тимуса (тимоцитов), характерное для тимомегалии, может быть результатом снижения интенсивности апоптоза, реализуемого в ходе селекции тимоцитов, или ослабления эмиграции зрелых Т-лимфоцитов из органа в периферический отдел иммунной системы. Прижизненная оценка интенсивности апоптоза внутри тимуса представляется затруднительной. В то же время существует метод определения уровня эмиграции Т-клеток по содержанию в Т-клетках крови Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК). ТРЭК представляют собой кольцевидные структуры, образованные ДНК, которые локализуются в составе эписом в цитоплазме клеток. Они образуются в ходе перестройки генов Т-клеточного рецептора, реализуемой при дифференцировке Т-лимфоцитов в тимусе [10]. В периферической крови ТРЭК определяются только в так называемых недавних мигрантах из тимуса (RTE — Recent thymic еmigrants) — Т-клетках, которые не пролиферировали после выхода из тимуса на периферию [12]. Поскольку при делении клеток эписомальная ДНК не подвергается репликации, пролиферативный процесс приводит к снижению числа ТРЭК-содержащих Т-клеток. В связи с вышесказанным уровень таких клеток в кровотоке рассматривается как показатель интенсивности процессов Т-лимфопоэза и эмиграции Т-клеток из тимуса [3, 12, 13]. Цель данной работы состояла в оценке функции тимуса путем определения уровня ТРЭК в популяции Т-лимфоцитов периферической крови у детей с тимомегалией. Содержание ТРЭК определяли у 8 детей с тимо-мегалией. Возраст семи детей составлял от 6 мес до 2 лет и лишь одному ребенку было 5 лет. У всех детей был диагностирован острый бронхит — простой или обструктивный. Число ТРЭК определяли также у 19 детей без тимомегалии, из которых 10 детей в возрасте от 1 года до 5 лет c бронхитами или ОРВИ составили группу сравнения для группы детей с тимомегалией и 9 детей в возрасте от 6 до 16 лет обследовались для оценки возрастной динамики числа ТРЭК. Характеристика численности Т-клеток, их субпопуляционного состава и функциональной активности осуществлена на основе обследования 70 детей с тимомегалией и 26 детей из группы сравнения без тимомегалии. Размер тимуса определяли рентгенологически. Мерой выраженности тимомегалии был кардио-тимико-торакальный индекс ( КТТИ), который рассчитывали как отношение ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы. Из периферической крови обследованных детей выделяли мононуклеарную фракцию путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-гипака (Sigma, США) плотностью 1,077 г/мл по методу А. Boyum. Численность и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Для определения Т-клеток использовали моноклональные антитела к CD3, Т-хелперы выявляли по окрашиванию комбинацией моноклональных антител к CD3 и CD4, цитотоксические Т-клетки — с использованием антител к CD3 и CD8, регуляторные Т-клетки — антител к CD4 и CD25 (учитывали клетки с высоким уровнем экспрессии CD25). В работе использовали моноклональные антитела фирм Becton Dickinson, США (анти-CD25, меченные фикоэритрином) и “Сорбент”, Москва (анти-CD3, анти-CD4, и анти-CD8, меченные флюоресцеинизотиоцианатом или фи-коэритрином). Для оценки пролиферации лимфоцитов в культуру мононуклеаров крови (0,5 х 106/мл среды) вносили фитогемагглютинин в конечной концентрации 10 мкг/мл и культивировали в течение 72 ч. За 18 ч до завершения культивирования в лунки вносили 40 кБк 3Н-тимидина и оценивали включение тимидина на счетчике β-сцинтилляций. Методы детально описаны в публикации [8]. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» («ДНК-Технология»). Метод основан на лизисе образцов в 4М растворе гуани-динтиоцианата, осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом с последующими отмывками этанолом и ацетоном, подсушиванием и растворением в специальном буфере. Выделение ДНК проводили из 1 · 106 клеток. Объем полученной ДНК составил 25 мкл. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, соотношение A260/280 составляло 1,6—2,0. Для постановки ПЦР использовали набор реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Для определения ТРЭК использованы следующие праймеры: прямой 5’-CGT GAG AAC GGT GAA TGA AGA GCA GAC A-3’, обратный 5’-CAT CCC TTT CAA CCA TGC TGA CAC CTC T-3’, а также флюоресцентно-меченный олигонуклеотид (зонд) 5’-FAM-TTT TTG TAA AGG TGC CCA CTC CTG TGC ACG GTG A-MGB-3’ [11]. Количество копий ТРЭК рассчитывали с использованием стандартной кривой, полученной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1 мкг ДНК. Для определения количества геномной ДНК использован β-актин (Applied Biosystems). Амплификацию проводили на приборе 7300 Applied Biosystems Real-time PCR System. Реакцию ставили в объеме 25 мкл (в реакцию брали 100 нг ДНК) Таблица 1 Численность Т-клеток и их субпопуляций в составе мононуклеаров крови и ответ Т-клеток на действие митогена у детей с тимомегалией в сопоставлении с контрольной группой соответствующего возраста Показатель Группа сравнения Тимомегалия CD3+ клетки % 79,8 ± 9,0 71,0 ± 12,1* 109/л 4,59 ± 0,93 3,19 ± 1,25* CD3+CD4+ клетки % 56,9 ± 10,7 51,2 ± 12,1* 109/л 3,23 ± 0,72 2,35 ± 1,04* CD3+CD8+ клетки % 21,4 ± 7,3 19,2 ± 6,1 109/л 1,25 ± 0,55 0,96 ± 1,03* CD4+CD25hi клетки % 4,19 ± 0,8 3,95 ± 1,49 109/л 0,22 ± 0,05 0,18 ± 0,09* Включение 3Н-тимидина, имп/мин спонтанное 4390 ± 2320 3900 ± 2200 ФГА-индуцированное 138 140 ± 58 600 115 040 ± 39 060* Примечание. * — p < 0,05. по следующей программе: 1 цикл — 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 50 циклов — 94°С 30 с, 60°С 30 с. Измерение уровня флюоресценции проводили на каждом цикле при температуре 60°С. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (с использованием t-критерия Стьюдента) и непараметрических (с использованием ^-критерия Манна—Уитни) методов. Ранее нами подробно охарактеризовано состояние популяции Т-лимфоцитов у детей с тимомегалией разной степени выраженности [2, 8]. Здесь мы ограничимся суммарными (без учета степени тимомегалии) данными о численности, субпопуляционном составе и функциональной активности Т-клеток у детей с тимо-мегалией в сопоставлении с показателями возрастной нормы. Данные табл. 1 свидетельствуют о значимом снижении относительного и абсолютного содержания Т-клеток (CD3+-лимфоцитов), в частности, Т-хелперов (CD4+CD3+), а также абсолютного содержания цито-токсических (CD3+CD8+) и регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hi). Значимо снижен уровень пролиферативного ответа мононуклеаров на Т-клеточный митоген фитогемаг-глютинин, что свидетельствует об ослаблении функциональной активности Т-лимфоцитов. Оценка содержания ТРЭК в мононуклеарах крови детей с тимомегалией в возрасте от 6 мес до 5 лет и детей без тимомегалии той же возрастной группы показала, что при тимомегалии число копий ТРЭК в пересчете на 1 мкг ДНК снижено в 6,18 раз (табл. 2). Наблюдаемые различия высоко достоверны. Даже если сделать поправку на более низкое содержание Численность ТРЭК в мононуклеарах крови детей возрастом до 4 лет с тимомегалией и без тимомегалии Таблица 2 Группа Средняя Медиана Минимум Максимум Нижний квартиль Верхний квартиль Группа сравнения (n = 10) 61 066 57 866 38 979 94 126 53 282 66 563 Тимомегалия (n = 8) 9 884 9 491 772 17 265 6 115 13 712 Примечание. p = 0,00078. Зависимость содержания ТРЭК в мононуклеарах периферической крови от возраста детей. Слева отмечены величины, характеризующие численность ТРЭК у обследованных детей по данным этой работы: * — с тимомегалией; о — без тимомегалии. Т-клеток у детей с тимомегалией (3,19 млрд Т-клеток в 1 л крови против 4,49 млрд Т-клеток в группе сравнения, т. е. в 1,44 раза меньше), умножив число копий у детей с тимомегалией на 1,44, полученная величина все равно будет многократно ниже, чем в группе сравнения — 4 461 против 13 304 копий на 1 мкг ДНК. Известно, что интенсивность эмиграции тимоцитов на периферию неуклонно снижается с возрастом [3, 10]. Нами рассчитана динамика числа ТРЭК в клетках крови здоровых детей в возрасте до 16 лет. При сопоставлении числа копий ТРЭК у детей от 6 мес до 5 лет с тимомегалией с показателями возрастной нормы (см. рисунок) оказывается, что оно со ответствует нормальным показателям, свойственным примерно 15-летним детям, у которых функциональная активность тимуса снижена по сравнению с детьми более раннего возраста. Таким образом, нами впервые получены прямые свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей первых лет жизни с тимомегалией.

作者简介

P. Vaganov

The N.I. Pirogov Russian research medical university

A. Donetskova

The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia

N. Nikonova

The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia

I. Danko

The N.I. Pirogov Russian research medical university

A. Yarylin

The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia

参考

补充文件