The relationship between process of peroxidation of lipids, activity of antioxidant system and fatty-acid composition of blood in patients with diabetes mellitus type I and under its complications

Full Text

Высокий уровень распространенности сахарного диабета (СД) и смертности от его осложнений обусловливает необходимость дальнейшего изучения механизмов развития этого заболевания. Известно, что токсическое действие гипергликемии обусловлено при СД накоплением в тканях продуктов неферментативного гликозилирования и образованием крайне реакционноспособных свободных радикалов, ослаблением антиок- сидантной защиты (АОЗ) и развитием окислительного стресса. Развивающийся на фоне гипергликемии ацидоз нарушает при этом течение многих ферментативных процессов в организме, активирует некоторые фосфоли- пазы и протеазы, что ведет к усилению распада фосфолипидов и белков и повышению концентрации ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) и усилению их пере- кисного окисления [1]. Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют важную роль в процессах перекисно- го окисления липидов (ПОЛ) и АОЗ организма. Роль ПНЖК в процессах ПОЛ связывается с их функцией как субстратов ПОЛ [2, 3]. Вместе с тем имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие [3, 4]. В связи с тем, что во время острой инсулиновой недостаточности происходит массивный липолиз, в сыворотке крови может значительно повышаться содержание свободных жирных кислот (ЖК) [5-8], поэтому возникают вопрос о возможной роли ПНЖК в формировании АОЗ крови, а также необходимость параллельной клинико-биохимической оценки показателей ПОЛ, АОЗ и жирно-кислотного состава плазмы крови у больных СД 1-го типа (СД-1). При этом особого внимания заслуживает выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОЗ и ПНЖК, так как ПНЖК входят в состав фосфолипидов клеточных мембран (КМ) и в значительной мере определяют их структурные и функциональные свойства [9, 10]. Между тем имеются лишь единичные работы, посвященные изучению жирно-кислотного состава крови при декомпенсации СД [7, 8, 11]. В связи с этим представляется целесообразным изучение состояние жирнокислотного обмена при СД и его осложнениях. Целью исследования явилось изучение взаимосвязи между процессом пероксидации липидов и активности системы антиоксидантной защиты от жирнокислотного состава крови у больных СД-1 в зависимости от наличия осложнений заболевания. У больных, страдающих СД, проводили комплексное исследование липидного состава сыворотки и КМ крови, степени ПОЛ, а также состояние ферментов АОЗ. Обследованы 70 больных в возрасте 29-36,7 года с СД-1; в контрольную группу вошли 20 практически здоровых мужчин и женщин без эндокринной патологии. Липидный состав, баланс ПОЛ-АОЗ и жирнокислотный спектр липидов сыворотки крови изучали в двух группах: 1-ю составили 27 больных СД-1 в стадии компенсации (средний возраст 32,5 ± 4,2 года; длительность заболевания 4,9 ± 1,8 года), 2-ю - 23 пациента с СД-1 c осложнениями (средний возраст 29 ± 4,2 года; длительность заболевания 6,4 ± 3,2 года). Больные 2-й группы поступали в стационар с осложнениями СД (хайропатия, нефропатия, полинейропатия, ретинопатия, кардиопатия). Показатели метаболизма глюкозы у них указывали на декомпенсированное течение заболевания: средний уровень гликилированного гемоглобина(HbAtс) 12,6%; суточная гликемия 11,26 ммоль/л; доза инсулина 0,95 ЕД/кг. Степень компенсации СД определяли с учетом содержания глюкозы в сыворотке крови утром натощак и концентрации HbA^. Компенсацию углеводного обмена у пациентов считали при показателе HbA^ ниже 7. Больные СД-1 получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме (от 0,35 до 1,66 ЕД/кг). Данное исследование одобрено комитетом по этике Российским национальным исследовательским медицинским университетом им. Н.И. Пирогова. Материалом для исследования служила венозная кровь. Экстракцию липидов из сыворотки крови проводили по методу J. Folch и соавт. [12], после чего осуществляли метилирование ЖК по методу [13] с дальнейшим анализом на газовом хроматографе ULTRA GC-ITQ 900 (США). Прибор калибровали стандартными смесями метиловых эфиров ЖК фирмы Sigma (США). Обсчет и идентификацию пиков проводили с помощью программно-аппаратного комплекса Anflytica for Windows с использованием IBM Pentium IV 1800. Определяли концентрацию следующих высших ЖК: миристиновой (С14:0), пальмитиновой (С 16:0), стеариновой (С 18:0), пальмито- лейновой (С16:1), олеиновой (С18:1), линолевой (С18: 2 омега-6), а-линоленовой (С18:3 омега-3), у-линоленовой (С18:3 омега-6), дигомо-у- линоленовой(С20:3 омега-6), арахидоновой (С20:4 омега-6). В соответствии с методиками в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА или гепарин. Об активности процессов ПОЛ в плазме крови и мембране эритроцитов судили по уровню гидроперекисей (ГП) и ДК, определяемого методом В.Б. Гаврилова [14], и содержанию продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК - активные продукты), которое определяли методом K. Yagi [15]. Концентрацию ГПО, СОД, КТ изучали с помощью наборов фирмы BioVision (США) на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 3200. Уровень общих антиоксидантов исследовали в сыворотке крови больных на биохимическом анализаторе SAPPHIRE 400 с использованием реактивов фирмы RANDOX (США). Содержание общего холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) определяли на том же анализаторе ферментным методом с помощью диагностических наборов фирмы Analitycon Biotechnologies AG (Германия) и BioSystems S.A. (Испания). Концентрацию липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП) оценивали по расчетной формуле У.Т. Фридевальда, уровень коэффициента атерогенности (КА) - по формуле А.Н. Климова. Статистическую обработку материала осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по /-критерию Стьюдента. При изучении характера взаимоотношений исследуемых параметров использовали коэффициент корреляции. Результаты исследований свидетельствуют, что у больных СД-1 отмечается повышение содержания ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольными значениями независимо от наличия осложнений (табл. 1). Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД-1 сопровождается существенными изменениями атерогенного характера. При этом у больных СД с осложнениями имеют место более выраженные изменения количественного состава липидов крови. Уро - вень КА повышался у них в 2 раза (р < 0,05) по сравнению с таковым в контроле на фоне повышения концентрации ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП. Повышение содержания общего ХС и ТГ в сыворотке крови сопровождалось снижением уровня ХС ЛПВП. Снижение содержания ХС в ЛПВП свидетельствует о нарушении метаболизма ХС, так как ЛПВП участвуют в акцепции ХС из тканей. Повышение содержания ТГ предполагает увеличение преимущественно содержания ЛПОНП. Результаты исследования данных показателей в крови у больных СД-1 при развитии осложнений (хайропа- тия, нефропатия, ретинопатия, нейропатия, кардиопатия и синдром Мориака) представлены в табл. 2. В обеих группах (как без осложнений, так и при их наличии) уровень эритроцитарного и плазменного малонового диальдегида (МДА), а также содержание ДК повышены в сравнении с таковыми в контроле. Также показано достоверное повышение уровня плазменного МДА при развитии осложнений по сравнению с аналогичным показателем у больных, не имеющих осложнений. По содержанию эритроцитарного МДА и ДК различий между группами не обнаружили. Развитие кетоацидоза у больных с осложнениями сопровождалось снижением уровня эритроцитарного МДА в сравнении с соответствующим показателем у больных без кетоза, но оставалось значительно выше, чем в контроле. При этом в общей группе больных СД-1 между уровнем кетоновых тел в крови и содержанием эритроцитарного МДА имелась отрицательная корреляционная связь с тенденцией к достоверности (г = -0,29; 0,1 > р > 0,05). Исходя из того, что основным субстратом ПОЛ являются ПНЖК, можно ожидать увеличения жесткости мембран, а следовательно, и нарушения проницаемости и функций данной клетки. Увеличение жесткости связано с изменением соотношения содержания ННЖК и насыщенных ЖК (НЖК) в сторону повышения уровня последних, так как прямые углеводородные цепи легче взаимодействуют между собой. Все эти изменения ли- Таблица 1 Изменение некоторых метаболических показателей крови у больных СД-1 с осложнениями и без осложнений (M±SD) Показатель Контроль СД-1 без осложнений СД-1 с осложнениями ЛПВП, мг/дл 292,8 ± 11,3 236,89 ±9,80 (р > 0,05) 298,19 ± 12,40 (р1 > 0,05; р21> 0,05) ЛПНП, мг/дл 457,06 ±16,1 435,71 ±12,50 (р1>0,05) 531,11 ±21,40 р > 0,05; р21> 0,05) ЛПОНП, мг/дл 53,47 ±3,9 53,45 ±4,90 (р1>0,05) 128,65 ±11,20 р < 0,01; р2< 0,01) Общий ХС, мг/дл 169,63 ±11,5 258,06 ±9,08 (р < 0,05) 323,50 ±10,40 (р1 < 0,001; р2 < 0,01) Общие ТГ, мг/дл 150,39 ±9,3 119,38 ±8,17 (р1 > 0,05) 213,67 ±11,50 (р < 0,001; р2 < 0,01) ХС/ФЛ 0,911 ±0,26 0,960 ±0,03 (р < 0,01) 0,960 ±0,09 (р1<0,01; р2 1> 0,05) ХС ЛПВП, мг/дл 57,87 ±8,7 43,91±7,01 (р1 < 0,05) 46,13 ±7,20 р < 0,05; р21> 0,05) ХС ЛПНП, мг/дл 2,6± 0,2 3,38±0,18 (р < 0,05) 3,38±0,06 (р < 0,05) Примечание: р - достоверность по отношению к контролю; р1 - достоверность различий по сравнению с показателями в контрольной группе; р2 - достоверность различий по сравнению с показателями у пациентов с СД-1; ФЛ - фосфолипиды. Таблица 2 Содержание МДА И ДК в эритроцитах и плазме крови при СД-1 с осложнениями и без осложнений (M±SD) Показатель Здоровые СД-1 лица без осложнений с осложнениями МДА в эритроцитах, мкмоль/мл 0,53 ±0,02 (n=28) 0,92±0,01 (р<0,001; n=25) 0,95±0,02 (р < 0,001; n = 17) МДА в плазме, мкмоль/мл 0,75 ±0,03 (n=28) 1,16±0,01 (р<0,001; n=25) 1,21±0,02 (р < 0,001; р2 < 0,05; n = 17) ДК в эритроцитах, ммоль/мл 0,57±0,03 (n=31) 0,97±0,05 (р<0,001; n=38) 0,96±0,07 (р < 0,001; n = 18) Примечание. р - статистически достоверные различия с показателями у здоровых пациентов; р2 - статистически достоверные различия с показателями у пациентов, не имеющих осложнений СД-1. Активность ферментов АОЗ у больных с осложнениями СД-1 и без осложнений (M±SD) Показатель Здоровые лица СД-1 без осложнений с осложнениями СОД, Ед/гНЬ 1113,55±51,76 (n = 20) 955,69±55,94 (0,1 > р > 0,05; n = 20) 765,80±130,87 (р < 0,01; n = 8) КТ, мкмоль ■ 104/ мин■гНЬ 8,71±0,18 (n = 23) 9,46±0,14 (р < 0,01; n = 19) 9,08±0,32 (n = 10) ГПО, мкмоль/ мин ■ гНЬ 89,69±2,01 (n = 10) 56,60±4,79 (р < 0,001) 53,38±2,76 (р < 0,001) Г-6-ФДГ, мкмоль/мин ■ НЬ 7,71±0,12 (n = 14) 4,40±0,18 (р < 0,001) 4,49±0,08 (р < 0,001) Примечание. р - достоверность различий с показателями в контроле. пидного состава являются результатом активации ПОЛ и становятся причиной нарушения структуры и функций КМ. Особенно важно при данной патологии усиление ПОЛ в Р-клетках островков Лангерганса, поскольку они имеют слабую АОЗ [10] и процессы ПОЛ в них наиболее выражены. При развитии осложнений СД-1 достоверно снижалась активность супероксиддисмутазы (СОД) по сравнению с таковой в норме, тогда как у больных без осложнений СД-1 достоверных изменений не отметили (табл. 3). При сравнении больных без осложнений и с их наличием выявили повышение активности каталазы (КТ) и как следствие повышение коэффициента КТ/СОД, а также снижение активности ГПО и коэффициента ГПО/СОД. Достоверно снижена активность Г-6-ФДГ в 1,75 раза. Это свидетельствует о том, что активность рассматриваемых ферментов претерпевает значительные изменения при СД-1 особенно с наличием осложнений болезни. СОД и КТ являются ферментами специфической АОЗ в организме, субстратами для которых служат активные формы кислорода (АФК). В связи с этим можно ожидать, что in vivo нарастание концентрации свободных радикалов также будет оказывать влияние на активность ферментов. В частности, повышение содержания Н2О2 которая является ингибитором СОД и субстратом для КТ, может стать причиной снижения активности СОД и повышения уровня КТ. Кроме того, между активностью ГПО и активностью каталазы, также обладающей пе- роксидазной активностью, имеется отрицательная кор - реляционная зависимость (г = 0,43; 0,1 >р > 0,05). Поэтому можно предположить, что нарастание концентрации Н2О2 в клетке и повышение активности каталазы могут повлиять на снижение активности ГПО, так как ГПО эффективна только при низкой концентрации Н2О2 [16]. У пациентов СД-1 отмечали повышение суммарного содержания НЖК и снижение суммарного содержания ННЖК по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе; наиболее выражены они у больных СД-1 с осложнениями (на 12,1 и 10,1% соответственно) (табл. 4). При подсчете коэффициента НЖК/ННЖК выявлено его повышение (на 13,7%) у больных с осложнениями СД-1. В пуле НЖК максимальное повышение отдельных фракций наблюдали также у больных СД-1 с осложнениями в начале госпитализации: миристиновой (С14:0) кислоты на 76%, пальмитиновой (С16:0) на 25,8%, стеариновой (С 18:0) на 24,8% по отношению к таковым в контрольной группе. Через 2 нед, т. е. в конце исследования, изменения во фракционном составе НЖК имели разнонаправленный характер: повышение уровня ми- ристиновой кислоты на 77%, а пальмитиновой кислоты на 19,4% по отношению к контрольным значениям. У пациентов 2-й группы, т. е. с осложнениями СД-1, в течение всего периода наблюдения отмечали умеренное снижение суммы полиеновых ЖК (ПННЖК) на 9,3% по сравнению с таковым в контроле. Результаты анализа концентрации отдельных ПННЖК показали, что уровень а-линоленовой (С18:3ш3) кислоты снизился на 63,7% по сравнению с аналогичным показателем в контроле, а также повысилось содержание арахидоновой (С20:4ш6) кислоты на 32% по отношению к контрольному. Таким образом, суммарный уровень ш6-ПННЖК был повышен при СД-1 в начале исследования в среднем на 60% по сравнению с таковым у здоровых лиц, а уменьшение коэффициента ш3-ПННЖК/ш6-ПННЖК (за счет низкой концентрации а-линоленовой кислоты на 17,3%, ЭПК на 50% и ДГК на 52% от контрольных значений) отмечали в течение всего периода наблюдения, особенно выраженным оно было через 2 нед после госпитализации. Изменения в содержании ПННЖК характеризовались снижением уровня Еш3-ПННЖК по сравнению с таковым в контроле; соотношение Еш3-ПННЖК/ Еш6-ПННЖК достоверно снизилось у диабетических больных без осложнений более чем в 2 раза (р < 0,05), c осложнениями - почти в 3,5 раза (р Таблица 4 Уровень ЖК в плазме крови у больных СД-1 с осложнениями и без осложнений по сравнению с таковыкм в контрольной группе (% от суммы ЖК, M±SD) Семейство ПННЖК ЖК Контроль СД-1 c осложнениями СД-1 без осложнений Ю3-ПННЖК 20:5 (ЭПК) 0,6±0,12 0,3±0,03* 0,5±0,08* 22:6 (ДГК) 2,2±0,8 1,0±0,23* 1,2±0,2* Ю6-ПННЖК 18:2 (линолевая кислота 24,0±3,5 39,3±5,4* 36,0±7,9* 20:3 (дигомо-у-линоленовая кислота) 0,3±0,05 0,6±0,2* 0,4±0,01 20:4 (арахидоновая кислота) 4,3±1,9 5,7±2,1* 5,3±1,8 Ею3-ПННЖК 2,8±0,1 1,3±0,2 1,7±0,1 Ею6-ПННЖК 28,6±3,1 45,6±4,2 41,7±6,3 ю3-ПННЖК/ю6-ПННЖК, ед. 0,097 0,028 0,040 Е НЖК 31,87±3,01 38,60±2,90* 35,32± 2,35* Е ННЖК 68,13±2,35 61,4±2,7* 64,68±3,21 НЖК / ННЖК, ед. 0,46±0,05 0,63±0,02* 0,55±0,01* Примечание. * - отличия достоверны по сравнению с показателями в контроле (р < 0,05); Е - сумма; ПННЖК ные ЖК. - полиненасыщен- < 0,01). Выявили прямые корреляционные взаимосвязи между активностью СОД и уровнем а-линоленовой кислоты (г = 0,53 ; р < 0 ,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО (г = 0,47; р < 0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрацией МДА и уровнем линолевой кислоты (г = 0,67; р < 0,05). Увеличение соотношения омега-6/омега-3 ПНЖК в крови у больных СД-1 сопровождается повышением активности и интенсивности ПОЛ, наиболее выражено (р < 0,05) это при наличии осложнений болезни. Суммарное соотношение омега-6/омега-3 (р < 0,05) снижается за счет повышения суммарной активности СОД+КТ (г = -0,763;р < 0,05; n = 19). Приведенные результаты свидетельствуют о том, что пациенты с СД-1 с осложнениями имеют более выраженные нарушения жирнокислотного состава сыворотки крови за счет группы ЖК омега-3 и омега-6, сохранявшиеся в течение всего периода наблюдения. У них отметили увеличение коэффициента НЖК/ ННЖК, максимально выраженное в начале исследования. По-видимому, эти изменения связаны с тем, что при ли- полизе в первую очередь мобилизуются ННЖК, которые и окисляются первыми [11, 13]. Можно предположить, что этим объясняется активация процессов ПОЛ у больных при СД-1 [1, 16]. У больных СД-1 отметили повышение уровня ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с таковым в контроле независимо от наличия осложнений. Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД -1 сопровождается дислипидемией атероген- ного характера. При этом у больных СД-1 с осложнениями имеют место более выраженные изменения количественного состава липидов, в том числе жирнокислотного состава крови, нарастание концентрации свободных радикалов и снижение активности ферментов АОЗ. Результаты исследования свидетельствуют о том, что СД -1 сопровождается дислипидемией атерогенного характера с активацией процессов липидной пероксида- ции, проявляющейся повышением содержания как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ, а также нарушениями в системе АОЗ. У пациентов с СД-1 отметили повышение суммарного содержания НЖК в основном за счет миристиновой кислоты, снижение суммарного содержания ННЖК по сравнению с таковым в контроле: наиболее выражено это у больных СД-1 с осложнениями. Выявили прямые корреляционные взаимосвязи между активностью СОД и уровнем а-линоленовой кислоты (г = 0,53 ; р < 0 ,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО (г = 0,47; р < 0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрацией МДА и содержанием линолевой кислоты (г = 0,67; р < 0,05). Увеличение соотношения омега-6/омега-3 ПНЖК в крови у больных СД-1 сопровождалось повышением активности и интенсивности ПОЛ, которое наиболее выражено (р < 0,05) при осложнениях СД-1. Суммарное соотношение омега-6/омега-3 снижалось (р < 0,05) за счет повышения активности СОД+КТ (г = -0,763; р < 0,05; n = 23). Таким образом, у больных СД-1 с осложнениями на фоне дисли- пидемии обнаружили существенные изменения как уровня, так и состава ЖК, нарастание концентрации свободных радикалов и снижение активности ферментов АОЗ.

About the authors

N. P Mikaeliyan

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

Email: ninmik@yandex.ru
117997, Moscow, Russia

A. E Gurina

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997, Moscow, Russia

H. Z Nguen

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997, Moscow, Russia

A. A Terentiyev

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997, Moscow, Russia

K. A Mikaeliyan

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997, Moscow, Russia

References

Supplementary files