THE EVALUATION OF FOLATE STATUS USING TOTAL HOMOCYSTEINE IN HYPERTENSIVE PATIENTS

Full Text

Введение В ряде когортных и эпидемиологических исследованиях показана связь прогрессирования гипертонической болезни (ГБ) с дефицитом фолиевой кислоты (ФК) [1-4], а также снижение показателей артериального давления (АД) под влиянием фармакотерапии препаратами ФК [5]. Механизм этой связи часто объясняют повышением чувствительности эндотелия к модуляторам, влияющим на выработку оксида азота [4], в том числе за счет коррекции гипергомоцистеинемии (ГГЦ) [6-9]. Дефицит ФК вызывает ГГЦ и влечет за собой не только понижение функциональной активности клеток, прежде всего нейронов, но и снижение скорости деления и дифференцировки клеток, что важно для гемопоэтических клеток и кишечного эпителия. Нарушения в каждом звене на пути переноса ФК из кишечника в клетку, включая связь с транспортными белками, удержание ФК в тканях с образованием полиглутаматных производных и тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФК), генетические дефекты ФК-зависимых ферментов и транспортных белков, депонирование в печени и потери в ходе экскреторной функции почек вносят большой вклад в формирование дефицита ФК [10, 11]. В большинстве случаев нарушение коферментной функции ФК проявляется в виде устойчивого снижения содержания 5-метил-ТГФК в плазме крови [12]. Дефицит ФК и витамина B12 в настоящее время рассматривается в различных областях медицины и биохимии питания, поскольку затрагивает все возрастные группы и является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире [13]. Обнаружение доказательных признаков фолиевого дефицита обеспечивает врачу неоспоримые и понятные для пациентов установки для рекомендуемой терапии и для изменения образа жизни. Так как дефицит ФК, в частности, возникает при хронических токсических воздействиях, включая воздействие этанола [14], объективное обнаружение ранних признаков дефицита ФК обеспечивает мотивацию для коррекции пищевых предпочтений и отказа от актуальных зависимостей. Недостаток ФК в плазме крови чаще всего сопровождается нехваткой ее активной формы ТГФК в тканях, то есть функциональным дефицитом ФК. Вследствие функционального дефицита ФК всегда возникает ГГЦ, но не всякая ГГЦ возникает только из-за недостатка активности метилентетрагидрафолатредуктазы (МТГФР), в составе которой ТГФК выполняет коферментную функцию, обеспечивая реметилирование гомоцистеина (Гци) в метионин [15]. Поэтому, очень важно иметь точное представление о том, когда же ГГЦ связана именно с дефицитом ФК, и какую роль в диагностическом процессе следует закрепить за данными лабораторных исследований. Для этого, в частности, следует остановиться на роли пограничных значений референтных интервалов для содержания ФК в плазме крови и возникновения ГГЦ. Широко известна следующая классификация ГГЦ. Умеренной называют ГГЦ, когда уровень общего гомоцистеина (оГци) находится в пределах от 10-15 до 30 мкМ, промежуточной или средней - от 30 до 100 и тяжёлой - выше 100 мкМ [3, 16, 17]. В этой классификации отразилась необходимость определиться с влиянием ГГЦ на прогрессирование атеросклероза, усиление склонности к тромбозам и влияниям на развитие плода [18, 19]. Таким образом, отрицательные токсические воздействия Гци в тканях и крови начинают проявляться при возрастании уровня оГци выше 15 мкМ. При терапии ГГЦ целевой уровень оГци ниже и локализован ближе к значениям в 4-6 мкМ, так как он в большей степени соответствует ожиданиям «правильного» метаболизма коферментных форм витаминов В6, В12 и ФК [19, 20]. Референтный уровень верхней границы, который связан не с токсическим влиянием самого Гци, а дефицитом ФК до настоящего времени четко не определён. В связи с этим, наибольший интерес для нас представлял анализ сочетания умеренной ГГЦ не только с пониженным, но в особенности с нормальным уровнем ФК. ГГЦ при отсутствии дефицита ФК в крови может объясняться: 1) функциональным дефицитом ФК в виде коферментных форм в клетке, 2) генетическими дефектами ферментов, а не недостатком их коферментных форм, 3) нарушением его утилизациив почках и печени в цистатиониновом метаболическом пути преобразования Гци в другие серосодержащие метаболиты, включая цистеин, таурин, сульфаты, сероводород и другие, 4) недостатком витамина В12. Целью настоящей работы была оценка значения оГци при умеренной ГГЦ в качестве показателя дефицита ФК в клетке у пациентов с ГБ, в том числе с хронической болезнью почек. Материал и методы Сбор клинического материала проводился с апреля по май 2018 года на базе клиник ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. В исследование включены образцы крови от 60 пациентов с гипертонической болезнью (ГБ) (17 мужчин и 53 женщины) в возрасте от 32 до 80 лет с распределением по возрасту 61 (45-70) лет, находящихся на стационарном лечении. Критерием включения в исследование было наличие ГБ с преимущественным поражением сердца и/или почек (МКБ 10 I11- I13), офисным АД свыше 130/80 мм рт. ст. и риском сердечно-сосудистых осложнений 1-4. Критериями исключения были: наличие заболеваний печени, эндокринных желез (за исключением сахарного диабета), онкогематологических и других онкопролиферативных заболеваний, острых воспалительных процессов, а также состояние беременности. Анализ состояния почечной функции пациентов с ГБ позволил разделить всех пациентов на две группы. Группу 1 составили пациенты (n = 31) без диагностированного заболевания почек и хронической почечной недостаточности. В группу 2 вошло 29 пациентов ГБ в сочетании с хронической болезнью почек (ХБП) со стадиями 1-5. В качестве группы сравнения использованы образцы от 30 здоровых лиц (11 мужчин и 19 женщин), регулярных доноров без артериальной гипертензии в возрасте от 30 лет до 61 года. Критериями включения в группу сравнения были удовлетворительное самочувствие, отсутствие хронических заболеваний в анамнезе, а также признаков острого воспалительного процесса. Все пациенты и доноры давали письменное согласие на анонимное использование получаемых лабораторных данных. Протокол исследования в соответствии с принципами Хельсинкской декларации был одобрен Этическим комитетом ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Демографические и общеклинические данные всех обследованных групп представлены в табл. 1. Материал исследования - плазма крови, взятой натощак из кубитальной вены до 10 часов утра в вакутейнеры с гепарином в качестве антикоагулянта. Процедуру отделения форменных элементов крови проводили в течение 1 часа от момента взятия крови. Кровь центрифугировали 15 минут при 580 g. Образцы плазмы до анализа хранили порциями по 1,0 мл при температуре -80ºС. Основные биохимические показатели определяли в клинико-диагностической лаборатории ПСПбГМУ им И.П. Павлова. Содержание глюкозы, креатинина, трансаминаз и C-реактивного белка (СРБ) определяли с помощью стандартных наборов фирмы Roche для биохимического анализатора Cobas Integra 400 Plus. Определение концентрации общего холестерина проводили с использованием наборов реактивов фирмы «Abbott Clinical Chemistry». Определение ФК. Концентрацию ФК в плазме крови определяли методом конкурентного иммунохемилюминесцентного анализа с использованием наборов реагентов и калибраторов, согласно инструкции производителя (Beckman Coulter Inc., США) и иммуноанализатора Access 2 Immunoassay System той же фирмы. Ключевым этапом данной методики является добавление в качестве реагента фолатсвязывающего белка коровьего молока (ФСБ), который позволяет отделить различные моноглутаматные формы ФК, включая основной компонент - 5-метил-ТГФК, от эндогенных транспортных белков [21]. Показано, что процентное соотношение собственно фолиевой кислоты и 5-метил-ТГФК в индивидуальных образцах может существенно различаться [22]. Далее после добавления конъюгата фолиевой кислоты со щелочной фосфатазой, то есть меченной формы ФК образуются, как меченные, так и не меченные комплексы ФСБ-фолаты. Они связываются первичными моноклональными мышиными антителами к ФСБ. Последующее добавление вторичных - козьих антимышиных антител с субмикронными парамагнитными частицами, позволяет перевести реакцию в твердую фазу. После промывания твердой фазы и добавления хемилюминесцентного субстрата щелочной фосфатазы люминометрически определяют интенсивность свечения, которая обратно пропорциональна концентрации фолата в пробе. Таким образом, использованный нами метод позволяет оценить суммарный уровень фолатов: как собственно фолиевую кислоту экзогенного происхождения, так и ее производное, которое в основном образуется внутриклеточно, то есть 5-метил-ТГФК без возможности их дифференцирования. В тексте данной статьи этот суммарный уровень фолатов обозначается как концентрация «ФК». Двусторонний референтный интервал для взрослых здоровых лиц составлял 13,4-56,2 нМ. Cодержание ФК в плазме крови выше 45,3 нмоль/л рассматривали как значение для «неметаболизированной ФК» или НМФК [23]. Определение концентрации витамина В12. Концентрацию витамина В12 определяли в плазме крови методом конкурентного иммунохемилюминесцентного анализа с использованием наборов реагентов и калибраторов, согласно инструкции производителя и иммуноанализатора Access 2 (Beckman Coulter Inc., США). Данный метод позволяет определить суммарное содержание метил-, дезоксиаденозил- и цианокобаламина, т.е. большинства форм витамина В12. Референтный диапазон здоровых лиц составляет 133-675 пМ. Концентрацию общего гомоцистеина в плазме осуществляли методом жидкостной хроматографии, как описано нами ранее [17, 24]. Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Statistica 10. Степень соответствия закона распределения данных нормальному распределению оценивали с помощью критериев Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (Me(Q1-Q3)). Для оценки межгрупповых различий использован непараметрический критерий Манна-Уитни. В случае сравнения нескольких независимых групп использовали тест Краскела-Уоллиса с поправкой Бонферрони. Корреляционный анализ проведен с применением критерия Спирмена. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05. Результаты Данные о биохимических показателях обследованных лиц отражены в табл. 2. У 28 из 60 обследованных пациентов отмечен пониженный уровень ФК. Содержание витамина В12 в плазме крови пациентов групп 1 и 2 между собой достоверно не различалось и колебалось у большинства пациентов в референтном диапазоне. По повышенному уровню мочевины, креатинина и снижению скорости клубочковой фильтрации значительно выделялась группа 2. Уровни глюкозы, холестерина, С-реактивного белка, фибриногена и активности трансаминаз между группами пациентов существенно не различались. Согласно полученным данным (рис. 1) уровень оГци у всех пациентов обратно коррелировал с уровнем ФК в крови (Rs = -0,39; p = 0,002). Только у одного пациента из группы 1 уровень ФК превышал значение, принятое для НМФК, равное 45,3 нМ. У этого пациента уровень оГци составил 4,4 мкМ, а ФК - 59 нМ. Как следует из данных табл. 2, у 75% доноров уровень оГци не превышал 10,9 мкМ. Этот уровень мы приняли за верхнюю границу референтного интервала содержания оГци у лиц старшей возрастной группы без патологических отклонений. Исходя из этого значения, умеренная ГГЦ обнаружена у 45 пациентов из 60. У пациентов 1 группы умеренная ГГЦ обнаружена у 18 пациентов, а пониженное содержание ФК - у 14. У 4 пациентов 1 группы недостаток ФК в плазме не подтверждался повышенным уровнем оГци, а у 9 - обнаружено повышение оГци 12,9 (12,5-19,0) мкМ при отсутствии недостатка ФК в плазме крови - 22,6 (15,8-26,6) нМ. Таким образом, дефицит ФК не всегда совпадал с ГГЦ, а отсутствие дефицита ФК в плазме не всегда совпадало с отсутствием ГГЦ. Необходимо отметить, что уровень оГци с возрастом имеет тенденцию значительно возрастать (рис 2, А). У пациентов второй группы по сравнению с донорами и пациентами первой группы отмечали значительно более высокий уровень оГци (рис. 2, Б). Достоверных отличий по уровням ФК между 1 и 2 группами пациентов не было обнаружено (см. табл. 2). Снижение уровня ФК в группе 2 обнаружена у 8 пациентов. Отрицательная корреляция между уровнями ФК и оГци в группе 2 (Rs = -0,53; p = 0,003) была более выражена, чем в группе 1 (Rs = -0,33; p = 0,07). Во второй группе пациентов обнаружена тесная отрицательная корреляционная связь между скростью клубочковой фильтрации (СКФ) и уровнем оГци (Rs = -0,75; р = 1×10-6), но отсутствовала положительная корреляция с уровнем ФК (Rs = 0,33; р > 0,05 ). Эта закономерность проявлялась также у вех обследованных пациентов (рис. 3 А, Б). Обсуждение Как показано в настоящем исследовании уровень оГци с возрастом у здоровых доноров постепенно возрастает, оставаясь в большинстве случаев не выше 10,9 мкМ (референтные интервалы см. табл. 2 ). Согласно данным [26, 27] уровни оГци у лиц старше 60 лет в среднем составляют 10,5 ± 5,5 мкМ (11,4 ± 6,1 для мужчин и 9,3 ± 4,5 для женщин), что показывает отсутствие разницы по этому показателю у здоровых доноров нашего региона в возрасте 55-61 год. Референтная граница в 10,9 мкМ обозначает уровень оГци, начиная от которого у пациентов возникает ГГЦ относительно здоровых доноров близких по возрасту. Пациенты, включенные нами в исследование, не получали до обследования лекарственные формы ФК, и у них закономерно обнаружена отрицательная связь уровня оГци с содержанием ФК. При этом обращает на себя внимание по результатам нашего исследования наличие ГГЦ у 9 пациентов из первой группы и у 8 из второй при отсутствии дефицита ФК в плазме крови. Врач, имеющий дело персонально с каждым пациентом, может предположить, что имеет дело со случаем недостаточного поступления ФК в клетки или недостаточную коферментную функцию ФК в цитоплазме клеток, то есть функциональный дефицит ФК. Следует учитывать также возможность пониженной активности МТГФР в клетке вследствие наследственных энзимопатий. В результате мутаций встречаются формы апофермента МТГФР с пониженным сродством к ТГФК или флавиновому коферменту, что в конечном итоге также приводит к ФК-дефицитному состоянию, которое нивелируется повышенными дозами препаратов ФК [28]. В этих условиях функциональный дефицит ФК обнаруживается при помощи определения оГци. С другой стороны у нескольких пациентов с пониженным уровнем ФК не встречалась ГГЦ, то есть у них не было функционального дефицита ФК. Определение оГци ниже 10,9 мкМ может использоваться для документирования отсутствия функционального дефицита ФК при ее пониженном уровне в плазме. Эта ситуация нами была обнаружена у 5 из 60 обследованных пациентов. Таким образом, обнаружение умеренной ГГЦ или её отсутствие позволяет определиться с наличием или отсутствием функционального дефицита ФК. Объективная оценка начала формирования функционального дефицита ФК особенно важна в свете частой встречаемости дефицита ФК при АГ [1, 2, 4, 8]. Доказана более частая встречаемость нехватки ФК по сравнению с В12 [8, 29, 31]. Роль почек в метаболизме Гци весьма значительна, преимущественно за счет большой метаболической активности цистатионинового пути утилизации Гци с образованием цистеина и других серосодержащих метаболитов - цистеина, таурина, сульфатов и сероводорода [32]. В нашей работе обнаружена четкая взаимозависимость метаболической и экскреторной функции почек, которая проявилась в корреляции уровня оГци и скорости клубочковой фильтрации (СКФ). Утилизация Гци в цистатиониновом пути дополняется реметилированием этого аминотиола в метионин с участием фолатзависимого фермента - МТГФР [16]. При нарушении экскреторной функции почек часто обнаруживают отклонения в метаболической функции других органов, в том числе тормозится всасывание, депонирование и удержание производных ФК в клетке [33, 34]. ГГЦ при ХБП прогрессирует не только за счет торможения цистатионинового пути, но и за счет аллостерической регуляции в патологических условиях, при которой нарушается фосфорилирование по треонину (Thr-34) МТГФР и, соответственно, повышается внутриклеточное соотношение S-аденозилгомоцистеина к S-аденозилметионину и из клетки нарастает поток свободного Гци. В этом явлении S-аденозилметионин функционирует не только как аллостерический ингибитор МТГФР, но также контролирует фосфорилирование фермента [35]. Применение препаратов ФК у этих пациентов несколько снижает ГГЦ, которая остается высокой [33]. Наряду с другими путями борьбы с ГГЦ, при хронических заболевании почек всегда предусматривается включение в терапию препаратов ФК [36]. Проведенное исследование также показало, что при получении результата с уровнем ФК и витамина В12 плазмы в пределах референтного интервала у пациентов может обнаруживаться умеренное, выше 10,9 мкМ, повышение уровня оГци, свидетельствующее о недостатке фолиевозависимой активности в реметилировании Гци в тканях (табл. 3). Это умеренное повышение уровня оГци вероятнее всего связано с нехваткой ТГФК в клетках в случае, если отсутствует нарушение функции почек. В случае же наследственных энзимопатий характерен более высокий уровень оГци, чем у пациентов с наблюдаемой нами умеренной ГГЦ в пределах от 10,9 до 14,1 мкМ. Подчеркнем еще раз, что оценка статуса ФК в организме должна происходить при учете данных о витамине B12 и с учетом предыдущих результатов определения ФК и оГци [37]. Суммируя полученные и другие имеющиеся данные, следует учитывать, что метаболический дефицит ФК без понижения в её уровня в плазме у пациентов с ГБ проявлялся в повышении уровня оГци выше 10,9 мкМ. При этом у пациентов не обнаруживалось понижения уровня витамина В12 и снижения СКФ. Следует отметить, что пациентов с умеренной ГГЦ и содержанием ФК в плазме крови выше 45,3 нмоль/л следует рассматривать как группу с «неметаболизированной ФК» или НМФК, или как группу с unmetabolized folic acid (UMFA) согласно [23]. Как указывают эти авторы, НМФК наблюдается на практике, когда лечение ФК в дозе 400 мкг в сутки в течение 14 недель не вызывает клинических положительных эффектов, несмотря на значительное повышение уровня ФК в плазме крови. В случае умеренного повышения оГци при содержании ФК от 13,4 и до 45,3 нМ (как это было в 9 случаях из 31 обследованных пациетов с ГБ без ХБП), то эту ситуацию следует рассматривать как потенциально перспективное состояние для терапии ФК. С учетом определения уровня ФК обозначающего переход в состояние НМФК нами предложен алгоритм определения функционального дефицита ФК (см. табл. 3). Как следует из данных табл. 3, внимание следует уделять случаям отсутствия ГГЦ при низком уровне ФК (ниже 13,4 нМ), что связано с особенностями метаболизма и свойствами МТГФР конкретного пациента. В этих случаях недостатка 5-метилТГФК в цитоплазме клеток не наблюдается для обеспечения реметилирования Гци. Суммируя изложенное, можно заключить, что после определения содержания ФК в плазме крови, следует не назначать препараты этого витамина, если его концентрация превышает 45,3 нмоль/л. Это связано с тем, что влияния на скорость реакций, зависящих от коферментных форм ФК, с большой вероятностью, оказано не будет даже в случае ГГЦ. Возможные причины ГГЦ в этом случае могут зависеть от мутаций генов МТГФР и цистатионинбеттасинтазы, недостатка витамина В12 и других ассоциированных с метаболизмов этих витаминов белков, а также нарушения метаболизма бетаинов. При меньших значениях содержания ФК (ниже 45,3 нмоль/л) в плазме крови и при ГГЦ выше 10,9мкМ следует использовать препараты ФК, применяя их до понижения уровня ФК в плазме ниже 10,9 мкМ. Вывод Используемый часто уровень оГци в 15 мкМ для обозначения начального пункта умеренной ГГЦ связан с нарастанием токсических концентраций самого Гци. Для определения функционального дефицита ФК при отсутствии пониженного уровня ФК в плазме крови следует использовать уровень оГци выше 10,9 мкМ. Благодарности. Авторы выражают благодарность менеджменту ПСПбГМУ им. И.П. Павлова за поддержку в организации исследования.

About the authors

Aleksandr A. Zhloba

I.P. Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: zhlobaaa@1spbgmu.ru
doctor of medical sciences, professor, Head of Biochemistry Department of Scientific and Educational Institute of Biomedicine “I.P. Pavlov First Saint Petersburg State Medical University”, 197022, Saint Petersburg, Russian Federation 197022, Saint-Petersburg, Russian Federation

T. F Subbotina

I.P. Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

197022, Saint-Petersburg, Russian Federation

References

Supplementary files