The impact of oxidative stress on state of insulin secretion and insulin-binding activity of blood cells under diabetes mellitus and its complications in children

Full Text

Известно, что выявление ранних форм сахарного диабета (СД) и своевременное эффективное лечение предупреждают прогрессирование заболевания [1, 2]. Распространенность и тяжесть течения СД 1-го типа, приводящего к ранней инвалидности и повышенной смертности, заставляет считать данное заболевание одной из ведущих медико-социальных проблем [1, 3]. Причина дальнейшего развития СД кроется в слабой эффективности действия инсулина, вызванной при СД 1-го типа нарушением инсу- линосекреции вплоть до абсолютной ее недостаточности [1, 2, 4]. Инсулин гетерогенен по своему составу, следовательно, антисыворотка к инсулину может реагировать с проинсулином и другими инсулиноподобными веществами, сходными иммунологически, но обладающими низкой биологической активностью. Поэтому изменение соотношения этих форм, как и изменение биологической активности самого инсулина, может приводить к нарушениям углеводного обмена, которые наблюдаются при СД [5]. Большинство исследователей СД воспринимают заболевание как «сбой» системы инсулин-глюкозного гомеостаза, лечебные мероприятия направляются на искусственное (насильственное) восстановление его параметров [5, 6]. Поэтому статистические и аналитические исследования привели к накоплению фрагментарных научных фактов. Между тем тяжесть течения СД 1-го типа у детей и подростков (с быстрым развитием гипоксии и других диабетических осложнений) свидетельствует о недостаточной ясности основных вопросов патогенеза данного заболевания, связанных с инсулиносекрецией и эффективностью действия инсулина при проведении терапии гормоном. Цель работы - оценка значения окислительного стресса (ОС) в нарушении инсулиносекреции и инсу- линсвязывающей активности клеток крови при СД 1-го типа и его осложнениях у детей. Материал и методы Под нашим наблюдением находились 137 детей и подростков, больных СД 1-го типа, в возрасте от 1 года до 18 лет. Все дети получали общепринятую комплексную терапию, в частности препараты инсулина. У большинства из них отмечали лабильное течение заболевания. Поскольку при обследовании при помощи известных методов не у всех пациентов диагностируются микроан- гиопатии и специфические диабетические осложнения, выявленные нарушения мы объединяли под термином «диабетические осложнения». Проводили комплексное Received 09.02.16 Accepted 22.03.16 исследование липидного состава сыворотки и мембран клеток крови, степени переокисления липидов, инсулинс- вязывающую активность (ПСА) клеток крови, а также состояние ферментов антиоксидантной защиты. Кровь из вены у пациентов брали утром натощак и через 1 ч после завтрака, с предварительным введением инсулина. Эритроциты, отделенные от плазмы, отмывали троекратным центрифугированием в среде Хэнкса без кальция и магния с pH 7,3 при 1900 об/мин в течение 10 мин. Для определения активности изпероксиддисмутазы (СОД) эритроциты предварительно лизировали в 5 Мм K-, Na-фосфатном буфере, pH 7,4, на ледяной бане, после чего геммсодержа- щие белки осаждали смесью хлороформ/этанол (3: 5). Об интенсивности перекисного окисления (ПОЛ) в выделенных плазматических мембранах (МЭ) судили по содержанию малонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей, которое оценивали в реакции с тиобарбитуровой кислотой [7]. Определение содержания диеновых конъюгатов (ДК) проводили в экстрактах эритроцитов, как описано у Л.И. Параничи и соавт. [8]. Активность каталазы определяли по методу на основе разложения перекиси водорода. Активность CuZn-СОД исследовали путем измерения процента торможения скорости реакции восстановления нитросинего тетразолия при неферментном образовании супероксидного радикала. Активность инсулиновых рецепторов исследовали по связыванию 12П-инсулина с лимфоцитами и эритроцитами по ранее описанному нами методу [9]. Инсулин и С-пептид определяли с помощью радиоиммунологических методов стандартными наборами фирм Cea-Sorin и Byk-Mallinckrodt. Концентрацию лактата и пирувата крови - при помощи наборов фирмы Boehringer. Статистическую обработку материала проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента. При изучении характера взаимоотношений исследуемых параметров использовали коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали достоверными приp < 0,05. Все средние значения в таблицах представлены в виде M ± SD. Данное исследование одобрено комитетом по этике РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Результаты и обсуждение Полученные нами данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о резком нарушении углеводного и липидного обмена как при начальном диабете, так и при Таблица 1 Показатели углеводного и липидного обмена (ммоль/л) и pH крови детей, больных СД в фазе декомпенсации (M ± SD) Обследованная группа Гликемия Лактат Пируват pH Неэстерифицированные жирные кислоты Свободный ХС Эфиры ХС Дети с сахарным диабетом (n = 45) Начальный диабет (n = 18) Здоровые дети (n = 20) 11,54 ± 1,6** 14,98 ± 0,72** 4,16 ± 0,34 1,56 ± 0,1 2,11 ± 0.2* 1,39 ± 0,05 0,08 ± 0,03 0,7 ± 0,02* 0,07 ± 0,001 7,38 ± 0,01 7,30 ± 0,01* 7,45 ± 0,001 0,68 ± 0,002 1,27 ± 0,04* 0,73 ± 0,03 3,67 ± 0,14** 4,73 ± 0,4** 2,15 ± 0,08 4,11 ± 0,4** 4,91 ± 0,02* 3,73 ± 0,25 Примечание. * - p < 0,05, ** - p < 0,01 - достоверны по отношению к контролю; ХС - холестерин. Клиническая медицина Таблица 2 Показатели инсулиносекреции у детей и подростков с начальным сахарным диабетом (M ± SD) Показатели инсулиносекреции Доза инсулина, ед/кг массы тела Группа пациентов с СД 1-го типа инсулин, мкед/мл С-пептид, нг/мл до завтрака после завтрака до завтрака после завтрака I. В фазе компенсации 1. Без осложнений (n = 30) 5,5 ± 1,2 13,7 ± 8,5 1,06 ± 0,3 1,34 ± 0,2 0,57 ± 0,08 2. С осложнениями (n = 12) 24,2 ± 16,7 54,6 ± 10,9 0,85 ± 0,33 1,05 ± 0,5 0,45 ± 0,06 II. В фазе декомпенсации (без кетоза) А. Без осложнений (n = 71) р (1-А) 37,6 ± 8,8 <0,001 72,5 ± 15,1 <0,001 0,52 ± 0,1 0,57 ± 0,2 <0,02 0,63 ± 0,04 Б. С осложнениями (n = 46) р (2-Б) 69,3 ± 20,17 60,4 ± 26,03 0,44 ± 0,12 0,52 ± 0,18 0,65 ± 0,05 <0,02 В. С кетозом (n = 6) р (А-В) 5,7 ± 0,9 51,5 ± 22,1 0 0,05 ± 0,01 <0,05 1,1 ± 0,42 Проведенное нами исследование состояния инсулиновых рецепторов показало, что у больных с лабильным течением СД 1-го типа и значительным снижением ин- сулиносекреции имеется тенденция к снижению ИСА эритроцитами (табл. 3) и лимфоцитами. У таких детей ИСА в лимфоцитах составляет 31,61 ± 3,9% (в контрольной группе - 47, 9 ± 5,9%, р < 0,01). В группе пациентов с впервые выявленным диабетом уровень эритроцитар- ного МДА повышается по сравнению с соответствующим показателем в группе контроля (см. табл. 3). При увеличении срока заболевания (более 1 мес) данный показатель еще более увеличивается в сравнении с контрольной величиной и достоверно превышает соответствующее значение в группе пациентов с впервые выявленным диабетом. Уровень плазменного МДА в обеих группах достоверно выше контрольной величины, но при увеличении срока заболевания повышение данного показателя недостоверно. Изменения содержания ДК имеют несколько иной характер. Из таблицы видно, что в дебюте заболевания уровень ДК резко повышается в сравнении с группой контроля. Таблица 3 длительном течении болезни. Отмечена выраженная гипергликемия (р < 0,01), независимая от длительности течения СД, но особенно значительная при начальной форме диабета, когда концентрация лактата и пирувата намного выше по сравнению с контрольной группой, и это приводит к сдвигу кислотно-щелочного равновесия в сторону метаболического ацидоза (снижение pH с 7,45 ± 0,01 до 7,3 ± 0,01, р < 0,05). Гиперлипидемия сопровождалась выраженной гиперхолестеринемией, особенно значительной в группе «Начальный диабет» (р < 0,01). При начальном СД у обследованных больных отмечена тенденция к снижению после завтрака уровня С-пептида в фазе декомпенсации по сравнению с пациентами в фазе компенсации (табл. 2), иными словами, с нарастанием тяжести состояния больного нарушения инсулиносекреции (ее снижение) усиливаются. Увеличение уровня инсулина после завтрака связано с введением пациентам экзогенного инсулина. Содержание МДА и ДК в эритроцитах и плазме крови и активность инсулиновых рецепторов, CuZN-СОД и каталазы в эритроцитах у детей и подростков с впервые выявленным сахарным диабетом 1-го типа (M ± SD) Показатели Здоровые СД -го типа 0-1 мес от начала заболевания более 1 мес от начала заболевания МДА в эритроцитах, 0,53 ± 0,02 0,88 ± 0,0 0,94 ± 0,01 мкмоль/мл (n = 28) р < 0,001 р < 0,001(n = 9) (n=6) р2 < 0,05 (n = 16) МДА в плазме, 0,75 ± 0,03 1,16 ± 0,03 1,18 ± 0,01 мкмоль/мл (n = 28) р < 0,001 р < 0,001(n = 8) (n = 6) ДК в эритроцитах, 0,57 ± 0,03 1,17 ± 0,17 0,94 ± 0,04 моль/мл (n = 31) р < 0,001 р < 0,001 (n = 8) (n = 6) 0,1 > р2 > 0,05 (n = 20) CuZn-СОД, 1113,55 ± 51,7 752,11 ± 201,92 946,24 ± 53,64 Ед/г НЬ (n = 20) р <0,05 р > 0,05 (n = 8) (n = 5) n = 13 КТ, 8,71 ± 0,18 9,03 ± 0,28 9,44 ± 0,14 мкмоль/г НЬ (n = 33) (n = 8) р < 0,01 (n = 21) ИСА, % 29,1 ± 3,9 25,3 ±1,9 21,8 ± 3,61 р < 0,01 р < 0,01 Примечание, р - статистически достоверные различия с показателями контрольной группы. Тенденция к более значительному снижению инсу- линосекреции отмечена у пациентов с ранним развитием гипоксии и других диабетических осложнений, т. е. при тяжелом течении болезни. Отметим, что у больных с тяжелым течением СД 1-го типа имеет место сочетание периферической гиперинсу- линемии и значительно сниженной инсулино- секреции на фоне тенденции к более высокой дозе вводимого в лечебных целях инсулина. В фазе компенсации у таких пациентов уровень инсулина в периферических венах оставался высоким, свидетельствуя о меньшей эффективности у них инсулина, необходимого для относительной нормализации углеводного обмена, в сравнении с больными с СД без осложнений. Видимо, восстановление собственной инсули- носекреции у пациентов без осложнений (судя по показателям С-пептида) в фазе компенсации способствует уменьшению периферической резистентности к инсулину. Причина улучшения состояния и метаболизма у больного - увеличение поступления эндогенного инсулина из поджелудочной железы непосредственно в печень через систему воротной вены, а не через общую циркуляцию (как при введении экзогенного инсулина). Поэтому очевидна важная роль сохранения остаточной инсулиносекреции для предупреждения прогрессирования тяжести СД 1-го типа у детей и подростков. В группе детей, болеющих более 1 мес, содержание ДК снижается с тенденцией к достоверности в сравнении с группой с впервые выявленным диабетом, но остается гораздо выше контрольной величины. Важное место в антиокислительной защите организма занимают ферменты CuZn-СОД и КТ. Показано, что уже в дебюте заболевания активность CuZn-СОД резко снижается по сравнению с контролем. В группе же пациентов, болеющих более 1 мес, существует только тенденция к снижению по сравнению с нормой. Различий между группами по изученным ферментам не найдено. Активность КТ в группе с впервые выявленным диабетом не отличается от контрольной величины. В группе пациентов (с длительностью заболевания более 1 мес) активность данного фермента достоверно повышается по сравнению с нормой. Полученные результаты свидетельствуют о том, что с первого месяца выявления СД 1-го типа в эритроци- тарных мембранах пациента имеет место активация процессов ПОЛ, интенсивность которых остается на высоком уровне в течение всего периода наблюдения. Корреляционный анализ в общей группе пациентов показал наличие положительных связей с тенденцией к достоверности между уровнем МДА как в эритроцитах, так и в плазме крови и продолжительностью СД 1-го типа (r = 0,29 и r = 57). При декомпенсации СД 1-го типа, особенно с наличием кетоза, а также при тяжелой степени диабета присоединяется синдром гипергликемии и гиперхолестеринемии [4, 10]. Известно, что избыточное образование продуктов ПОЛ оказывает повреждающее действие на уровне клеток; их цитотоксичность связана с накоплением перекисей липидов [11, 12]. При этом свободные радикалы участвуют в деструкции эндотелия, блокируют синтез белка и нуклеиновых кислот, подавляют гликолиз, способствуют разобщению окислительного фосфорилирования и ингибируют активность некоторых ферментов (глюкозо-6- фосфатазы, аденилатциклазы и др.), что приводит к нарушению функции многих тканей [13]. У пациентов с СД 1- го типа нарушено равновесие между активностью ПОЛ и системой антиоксидантной защиты и скорость ПОЛ превышает способность антиоксидантной системы «гасить» избыточное количество свободных радикалов. Таким образом, СД - заболевание, сопровождающееся системными метаболическими нарушениями, обусловливающими повышение синтеза свободных радикалов и снижение антиоксидантных защитных механизмов, реализующихся в активации ОС. Результаты наших исследований свидетельствуют о значительной роли активации ОС и угнетении функции инсулиновых рецепторов в патогенезе диабетических осложнений, что предполагает необходимость использования эффективных лекарственных средств, обладающих антиокси- дантной активностью. Выводы 1. Прогрессирующее снижение остаточной инсули- носекреции у детей и подростков и развитие инсулино- резистентности являются факторами риска тяжелого течения СД 1-го типа с быстрым развитием диабетических осложнений. 2. Метаболические изменения, сопровождающиеся стойким нарушением углеводного и липидного обмена, высоким уровнем переокисления липидов с нарушением активности ферментов антиоксидантной защиты с до- Clinical medicine стоверным снижением инсулинсвязывающей активности клеток крови свидетельствуют о наличии ОС у детей. 3. Для профилактики ухудшения состояния пациента с прогрессированием тяжести течения болезни необходимо учитывать метаболические нарушения, наличие остаточной инсулиносекреции, поскольку это определяет применение адекватных доз инсулина и эффективных средств, обладающих антиоксидантной активностью. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Nina P. Mikaelyan

The N.I. Pirogov Russian national research medical university

Email: ninmik@yandex.ru
doctor of biological sciences, medical faculty 117997, Moscow, Russia

A. E Gurina

The N.I. Pirogov Russian national research medical university

117997, Moscow, Russia

V. V Smirnov

The N.I. Pirogov Russian national research medical university

117997, Moscow, Russia

A. V Mikaelyan

The N.I. Pirogov Russian national research medical university

117997, Moscow, Russia

A. A Terentyev

The N.I. Pirogov Russian national research medical university

117997, Moscow, Russia

References

Supplementary files