THE T-CELL IMMUNITY IN CHILDREN WITH MEGALOTHYMUS

Full Text

Тимомегалия (лат. Thymus - тимус, megalia - увеличение) - это состояние, наблюдающееся преимущественно у детей раннего возраста, при котором отмечается увеличение объёма и массы вилочковой железы выше предельных возрастных значений с сохранением нормальной морфологической структуры этого органа [1, 2]. В настоящее время для обозначения данного состояния часто используют термин «синдром увеличенной вилочковой железы» [3]. Существует точка зрения, что увеличение тимуса у детей грудного возраста является вариантом нормы, но есть и противоположное мнение, рассматривающее тимомегалию как патологию: проявление аномалии развития и функционирования нейро-иммунно-эндокринной системы [1, 4, 5]. В ряде работ показано, что дети с увеличением вилочковой железы чаще болеют инфекционно-воспалительными и аллергическими заболеваниями с осложнённым течением, нередко заканчивающимся неожиданным летальным исходом [6, 7]. В зарубежной литературе проблема увеличенной вилочковой железы в основном рассматривается в плане дифференциальной диагностики с опухолями тимуса (при миастении) и средостения, перикардитом, плевритом и другими состояниями [8-10]. Таким образом, единого мнения относительно природы и клинической значимости тимомегалии до сих пор не сложилось [6, 11]. Неясно, следует ли рассматривать увеличение размеров тимуса как первичный процесс [7, 12], отражающий дефект развития этого органа и проявляющийся иммунодефицитом, или это вторичное проявление нарушений эндокринной регуляции тимуса с первичной гипофункцией коры надпочечников [5, 13]. Поскольку тимус является центральным органом иммунной системы, в котором осуществляется развитие, созревание и дифференцировка Т-лимфоцитов, можно предположить нарушение Т-клеточного иммунитета при тимомегалии. Действительно, в предыдущих работах обнаружены признаки гипофункции Т-клеточного звена иммунной системы: снижение численности Т-лимфоцитов и изменение их субпопуляционного состава [3, 6, 7, 11]. В настоящей работе, помимо оценки субпопуляционного состава Т-лимфоцитов (в том числе Т-регуляторных клеток), мы оценили функциональную активность тимуса и Т-лимфоцитов при тимомегалии. Функциональную активность тимуса оценивали по содержанию в Т-лимфоцитах крови Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК), которые представляют собой кольцевидные структуры ДНК, образующиеся в процессе перестройки генов Т-клеточного рецептора в тимусе, коррелирующие с интенсивностью Т-лимфопоэза и эмиграцией Т-клеток из тимуса [14, 15]. Материал и методы Обследовано 70 детей с тимомегалией в возрасте до 1 года, находившихся на стационарном лечении в Морозовской детской клинической больнице в связи с заболеваниями респираторного тракта (ОРВИ, обструктивные бронхиты). Группа сравнения включала 25 детей без тимомегалии с ОРВИ/обструктивным бронхитом. Содержание ТРЭК определяли у 32 детей с тимомегалией и у 18 детей без тимомегалии в возрасте до 1 года. Размер тимуса устанавливали рентгенологически на основе величины кардио-тимико-торакального индекса (КТТИ): отношение ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы. Тимомегалия I степени (КТТИ 0,33-0,36) выявлена у 9 детей, II (КТТИ 0,37-0,42) - у 40, III (КТТИ 0,43 и более) - у 21 ребёнка. Из периферической крови обследованных детей выделяли мононуклеарную фракцию путём центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-верографина (плотность 1,077 г/мл) по методу A. Boyum [16]. Мембранный фенотип клеток оценивали методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, меченных флуорохромами. Клетки инкубировали с моноклональными антителами в PBS (фосфатно-солевом буфере) с 1% BSA (бычьим сывороточным альбумином) и 0,1% NaN3 в течение 30 мин при +4°C. Использовали моноклональные антитела к CD3, CD4, CD8, меченные флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), и антитела к CD25, HLA-DR, меченные фикоэритрином (PE) (Becton Dickinson). Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6. Для оценки пролиферации лимфоцитов в культуру мононуклеаров крови (0,5 ∙ 106 на 1 мл среды) вносили фитогемагглютинин (ФГА) в конечной концентрации 10 мкг/мл и культивировали в течение 72 ч. За 18 ч до завершения культивирования в лунки вносили 40 кБк 3H-тимидина и оценивали включение тимидина на счётчике β-сцинтилляций. Результаты выражали в импульсах в минуту (имп/мин). Для оценки ответа лимфоцитов на действие митогенов рассчитывали индекс стимуляции: отношение включения метки в присутствии и в отсутствии митогена. Клетки, продуцирующие цитокины, определяли общепринятым методом [17]. Для индукции синтеза цитокинов к клеткам добавляли форболмиристат ацетат (ФМА, Sigma) в концентрации 25 нг/мл и иономицин (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл. Для предотвращения выхода цитокинов из клеток добавляли брефелдин A (Golgy Plug, Becton Dickinson). После культивирования в течение 18 ч лимфоциты дважды отмывали, фиксировали 4% раствором параформальдегида в течение 10 мин при 4°C и дважды отмывали PBS. Лимфоциты пермеабилизировали в 0,1% растворе сапонина (Sigma) в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Для выявления внутриклеточных цитокинов к клеткам, осаждённым центрифугированием, добавляли антитела к CD3, меченные FITC, и антитела к IFNγ или к IL-4, меченные PE (Becton Dickinson). После 30-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте клетки отмывали от несвязавшихся антител 0,1% раствором сапонина, фиксировали 1% параформальдегидом (Sigma) и исследовали методом проточной цитометрии. Для выделения нуклеиновых кислот (из 1 млн клеток) использовали наборы «Проба НК» (ДНК-Технология). Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, соотношение A260/280 составляло 1,6-2,0. Для постановки ПЦР использовали набор реагентов TaqMan Univrsal PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Для определения ТРЭК использованы следующие праймеры: прямой 5’-CGT GAG AAC GGT GAA TGA AGA GCA GAC A-3’, обратный 5’-CAT CCC TTT CAA CCA TGC TGA CAC CTC T-3’, а также флуоресцентно-меченный олигонуклеотид (зонд) 5’-FAM-TTT TTG TAA AGG TGC CCA CTC CTG TGC ACG GTG A-MGB-3’ [14]. Расчёт количества копий ТРЭК проводили с использованием стандартной кривой, полученной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1 тыс лимфоцитов. Для определения количества геномной ДНК использован β-актин (Applied Biosystems). Амплификацию осуществляли на приборе 7300 Applied Biosystems Real-time PCR System по следующей программе: 1 цикл - 50°C 2 мин, 95°C 10 мин; 50 циклов - 94°C 30 с, 60°C 30 с. Измерение уровня флуоресценции выполняли на каждом цикле при температуре 60°C. Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представляли в виде Me (L-H), где Me - медиана, L - нижний квартиль, H - верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при p < 0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica 7.0. Результаты и обсуждение В табл. 1 и 2 представлены показатели, позволяющие сопоставить численность Т-лимфоцитов и их субпопуляций, а также некоторых активационных молекул на мононуклеарных клетках у детей с тимомегалией и в группе сравнения. Статистически значимые отличия всех детей с тимомегалией (независимо от степени процесса) от группы сравнения, обнаружены по всем исследованным показателям Т-клеточного иммунитета: все показатели у детей с тимомегалией были ниже, чем в группе сравнения. Обнаружено значимое снижение относительного и абсолютного содержания Т-клеток (CD3+), абсолютного содержания Т-хелперов (CD4+ Т-клеток), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ Т-клеток) и регуляторных Т-клеток (CD4+ CD25hi). Также снижено содержание активированных Т-клеток (CD4+ CD25lo и CD3+ HLA-DR+). При сопоставлении изменений показателей со степенью тимомегалии в целом наблюдалось усиление их выраженности по мере прогрессирования тимомегалии, в наибольшей степени это касалось изменения содержания лимфоцитов (см. табл. 1 и 2). При тимомегалии I степени относительных изменений показателей Т-клеточного иммунитета не выявлено, однако наблюдалось снижение абсолютного содержания Т-клеток, в частности Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и регуляторных Т-клеток (CD4+ CD25hi), уровень активационных молекул был в норме. При тимомегалии II степени изменения затрагивали все звенья Т-клеточного иммунитета, однако экспрессия молекул активации была не нарушена. При крайней степени тимомегалии (III) было снижено абсолютное содержание всех Т-лимфоцитов (Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов), также нарушена экспрессия активационных молекул, при этом уровень регуляторных Т-клеток увеличивался и приближался к показателям возрастной нормы. Подобные изменения могут свидетельствовать о декомпенсации процесса и нарастании иммунодефицита, поскольку регуляторные Т-клетки играют важную роль в подавлении иммунного ответа. При дополнительном изучении эффекта активации лимфоцитов in vitro (пролиферативный ответ на ФГА) отмечено некоторое снижение включения 3H-тимидина у детей с тимомегалей I и II степени, при тимомегалии III степени отмечалась тенденция к росту этого показателя (табл. 3). Однако статистически значимых изменений функциональной активности периферических Т-лимфоцитов не выявлено. Исследование содержания Т-клеток, продуцирующих ключевые цитокины Th1- и Th2-клеток (IFNγ и IL-4, соответственно) при стимуляции ФМА и иономицином in vitro, показало отсутствие значимых отклонений этих показателей от уровня в контроле. Исключение составило снижение абсолютного содержания Th2-клеток у детей с тимомегалией I степени. Причём, как следует из табл. 4, при тимомегалии I степени отмечалось снижение обоих типов цитокинпродуцирующих клеток по сравнению с контрольной группой (Th1 - статистически незначимо), при тимомегалии II степени выявлено приближение их к уровню контроля, а при тимомегалии III степени - относительное его превышение, хотя и незначимое статистически. Следовательно, способность Т-клеток к дифференцировке в цитокинпродуцирующие клетки типов Th1 и Th2 возрастает по мере увеличения выраженности тимомегалии, однако практически не выходит за рамки, свойственные группе сравнения. Итак, тимомегалия у детей сопряжена с Т-лимфопенией, затрагивающей как CD4+, так и CD8+ клетки, причём эти изменения нарастают параллельно увеличению степени тимомегалии. Поскольку увеличение размеров тимуса (тимомегалия) неизбежно сочетается с нарастанием числа тимоцитов, можно предположить «задержку» незрелых Т-клеток в тимусе и нарушение притока зрелых Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы. В настоящей работе мы провели оценку содержания клеток, недавно эмигрировавших из тимуса, по уровню ТРЭК в мононуклеарах периферической крови. Было выявлено статистически значимое снижение числа копий ТРЭК в пересчете на 1 тыс лимфоцитов у детей с тимомегалией (табл. 5). Наблюдаемые различия высоко достоверны (p = 0,00078). Снижение числа ТРЭК не коррелировало со степенью выраженности увеличения тимуса (данные не представлены). Если сделать поправку на более низкое содержание Т-клеток у детей с тимомегалией (у детей с тимомегалией 4,19 млрд Т-клеток в 1 л крови при 5,51 млрд Т-клеток в группе сравнения, т. е. в 1,32 раза меньше), полученная величина будет ещё ниже, чем в группе сравнения - 119,6 млн против 431,7 млн Т-клеток, недавно эмигрировавших из тимуса, в группе сравнения. Таким образом, нами получены свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей первого года жизни с тимомегалией. Эти изменения вызывают функциональный дефицит Т-клеточного звена иммунной системы и могут способствовать проявлению её несостоятельности, особенно в условиях повышенной нагрузки при воздействии патогенов. Поэтому детей с тимомегалией можно рассматривать как детей из группы риска, предрасположенных к более частым заболеваниям. Также следствием ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса может быть недостаточная элиминация «ненужных» и «опасных» клонов тимоцитов (приводящая к повышению клеточности тимуса, т. е. тимомегалии) и снижение эмиграции зрелых Т-клеток (приводящее к Т-лимфопении).

About the authors

P. D Vaganov

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997, Moscow, Russian Federation

M. F Nikonova

The state research center «The institute of immunology» of the Federal medical biological agency of Russia

115478, Moscow, Russian Fedration

E. Yu Yanovskaya

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997, Moscow, Russian Federation

E. T Mandzhieva

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia

117997, Moscow, Russian Federation

Almira D. Donetskova

The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia; The state research center «The institute of immunology» of the Federal medical biological agency of Russia

Email: almira_donetskova@yahoo.com
doctor of medical sciences, leading researcher of the laboratory of differentiation of lymphocytes. the state research center «The institute of immunology» of the Federal medical biological agency of Russia, 115478, Moscow, Russian Fedration 117997, Moscow, Russian Federation; 115478, Moscow, Russian Fedration

References

Supplementary files