ABNORMALITY IN LEARNING ON THE MODEL OF PARKINSON-LIKE SYNDROME: THE CORRECTABILITY BY THYMUS PEPTIDES

Full Text

Известно, что цитокины, продуцируемые макрофагами, проникшими в центральную нервную систему, приводят к воспалительному процессу в мозге [1, 2], как при острых (инсульт или травмы головы), так и при хронических (рассеянный склероз и болезнь Альцгеймера) заболеваниях головного мозга. Тонкий баланс между про- и противовоспалительными цитокинами определяет направление динамики дальнейшего ответа. В случае сдвига в сторону продукции провоспалительных цитокинов, интерлейкина 1 и фактора некроза опухоли α инициируется процесс нейродегенерации [3]. Под действием же противовоспалительных цитокинов, продукция которых контролируется, в частности, тимусом и его гормоном тимулином, проявляются нейропротективные эффекты. Преобладание нейротоксических или нейропротективных процессов в организме зависит от функционирования тимуса, а также от активности регуляторных реакций, которые определяют синтез, секрецию и доставку в ткани и клетки мозга биологически активных пептидов, в том числе цитокинов [2, 4]. Конкретные реакции и процессы этих взаимодействий являются в настоящее время предметом интенсивных исследований [5-7]. Изменения активности биологически активных пептидов обуславливает рост нейродегенартивных заболеваний. Принимая во внимание вероятную роль некоторых цитокинов в патогенезе болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона [8, 9] и возможность изменения продукции цитокинов в центральной нервной системе с помощью регуляторных пептидов, актуальным является изучение влияния пептидных препаратов на когнитивные и поведенческие особенности животных с искусственно индуцированными нейродегенеративными заболеваниями. Взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем являются двунаправленными и включают, с одной стороны, контроль функций тимуса за счет гормонов и нейропептидов, и с другой - воздействие на мозг пептидов, контролируемых тимусом [10-12]. Тимус продуцирует специфические белки и пептиды, которые или непосредственно воздействуют на центральную нервную систему, или индуцируют высвобождение цитокинов, в первую очередь интерлейкинов, периферическими иммунными клетками. Цитокины могут поступать в мозг путем активного транспорта или через нарушенный гематоэнцефалический барьер [10]. Присутствие ряда цитокинов, интерлейкинов 1, 2, 3, 6, 8 и 12, интерферона γ и фактора некроза опухоли α было показано в мозге экспериментальных животных [10]. Цитокины регулируют важные функции нейронов, такие как апоптоз и выживание, а также стимуляцию нервных клеток и высвобождение ими нейропептидов и нейротрансмиттеров [12]. Более глубокое понимание механизмов нейро-иммунных воздействий и определяющих их факторов важно для оптимизации терапии ряда инфекционных, аутоиммунных или нейродегенеративных заболеваний. Цель данной работы состоит в исследовании влияния пептидных препаратов, полученных из органа иммунной системы - тимуса, на выработку условного рефлекса активного избегания, как в норме, так и в модели паркинсоноподобного синдрома. Материал и методы Работа была выполнена на 80 самцах крыс Wistar массой 300-350 г. Крысы содержались в пластиковых клетках при постоянной температуре (+21+22°С) при 12-часовом световом дне и имели неограниченный доступ к воде и пище. Поскольку болезнь Паркинсона развивается у больных старшей возрастной группы, то для проведения данной работы были выбраны животные, возраст которых составил 1,5 года. Исследование проводили в 4 экспериментальных группах. Проводили 2 серии экспериментов, по 10 особей в группе (схема эксперимента представлена в табл. 1). В серии 1 (норма) животным внутрибрюшинно вводили препараты в объеме 0,5 мл: 1 группа - 0,9% р-р NaCl (контроль), 2 группа - тималин (Самсон-Мед, Россия) в дозе 0,5 мг/кг, 3 группа - тимозин фракция 5 (Hoffmann-La Roche Inc., Швейцария) (0,5 мг/кг), 4 группа - интактные животные (для дополнительного контроля). Дозы тимических пептидных препаратов (тимозина фракции 5 и тималина) были эквивалентны эффективной дозе препарата полипептидов тимуса тактивина (ОАО Биомед им. И.И. Мечникова, Россия), подобранной экспериментально [13] на основании того, что пептидные препараты, выделенные из тимуса, оказывают одинаковое иммуномодулирующее действие, независимо от метода их выделения, что свидетельствует о высокой степени гомологии пептидных последовательностей, содержащихся в экстракте тимуса [14]. Для исследования влияния веществ на обучение и память у крыс вырабатывали условный рефлекс активного избегания (УРАИ). Во второй серии экспериментов 30 животным (по 10 крыс в группе) однократно вводили по 50 мкл раствора 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) в концентрации 20 мг/мл в каждую ноздрю [15] для получения МФТП-индуцированной модели болезни Паркинсона. Интактным крысам (n=10) - по 50 мкл физиологического раствора в каждую ноздрю. Каждое животное помещали в плексигласовый цилиндр (время нахождения в котором не более 2 мин) для проведения интраназального введения веществ с помощью микропипетки с мягким наконечником. Через 10 дней после введения раствора МФТП [16] этим крысам внутрибрюшинно вводили лекарственные средства, как описано в серии экспериментов 1. Через 5 дней введения веществ (1 инъекция 1 раз в сутки) оценивали моторные нарушения, вызванные введением нейротоксина по 4-бальной шкале. Оценивали: 1) тремор конечностей и головы; 2) наличие замедленной стартовой реакции до начала движений; 3) отсутствие возможности остановить начатое движение без столкновения с препятствием (стенка камеры), 4) нарушение координации - падение из стоек, неспособность пройти по прямой, походка на пальцах задних лап, а не на полной стопе. Наличие каждого нарушения принимали за 1 балл. Все эксперименты проводили согласно «Принципам надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice, GLP), ГОСТ 33647-2015) и положениям международной конвенции о «Правилах работы с экспериментальными животными» (European Communities Council Directives, November 24, 1986, 86/609/EEC). Выработку УРАИ у крыс проводили в челночной камере размером 60×30×30 см, разделенной перегородкой с отверстием (10×10 см) на два одинаковых отделения размером 30×30 см. Отделения были снабжены электрифицированным решетчатым полом из стальных прутьев диаметром 0,6 см, расстояние между которыми - 1 см. Исследование проводили при электрическом освещении 3000 люкс. Выработку УРАИ начинали с определения порога индивидуальной чувствительности животного к электрическому току. Пороговым значением считали минимальное напряжение тока, на которое животное отвечало двигательной реакцией [17]. К условному раздражителю (звук 700 Гц) через 10 с изолированного действия подключался безусловный раздражитель - электрический ток силой 0,4-0,9 мА. При переходе животного через отверстие в другую половину камеры во время действия тока (реакция избавления) звук и ток выключали. Если животное переходило во время следования только звукового сигнала (реакция избегания), то тока не следовало, а звук прекращался. Если животное не совершало перехода при действии раздражителей, то через 10 с после включения тока они выключались автоматически. Каждый опыт состоял из 25 предъявлений с 30-секундным межсигнальным периодом. Опыты проводили ежедневно в течение 7 дней до формирования устойчивого рефлекса, который оценивали по критерию обученности (более 80% реакций избегания от числа предъявлений). Фиксировалось количество реакций избегания, избавления и межсигнальных реакций (МСР). Сравнение количества реакций избегания и МСР проводили с использованием непарного критерия Манна-Уитни для межгруппового сравнения каждого из тимических пептидов по отдельности с группой контроля, а также с группой интактных животных (сравнивали две независимые переменные), отдельно проводили сравнение между контрольными и интактными животными в компьютерной программе «Statistica 8.0». Результаты У здоровых животных (серия экспериментов 1) не наблюдали статистически значимых различий между интактными и контрольными животными по показателю количество реакций избегания, а также при появлении 1, 5 подряд и 10 подряд реакций избегания (рис. 1, табл. 2). При изучении влияния пептидных лекарственных средств у здоровых животных на формирование реакции избегания показано, что тималин и тимозин фракция 5 ускоряют процесс обучения по сравнению с контрольной и интактной группами (рис. 1). Первые реакции избегания, а также 5 и 10 подряд реакции избегания у животных, которым вводили тимические препараты, появлялись раньше (см. табл. 2). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что процесс обучения на фоне тимических препаратов происходит значительно быстрее, чем в контрольной и интактной группах, как это следует из сопоставления числа предъявлений условного и безусловного стимулов, необходимых для совершения реакции избегания до критерия 80% (см. рис. 1). В 1-й день выработки рефлекса статистически значимых различий между всеми экспериментальными группами не наблюдалось. Начиная со 2-го дня у животных на фоне тимических препаратов процент условных реакций избегания статистически значимо (р<0,05) превышал данные показатели относительно контрольной и интактной групп. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что процесс обучения в группах животных, получавших тимические пептиды, происходил значительно быстрее, чем в контрольной и интактной группах. Начиная с 1-го дня обучения, у животных на фоне тимических препаратов процент МСР статистически значимо (р<0,05) ниже, чем у групп сравнения, однако данные различия исчезали на 2-й день выработки рефлекса (рис. 2). С 3-го дня обучения, наблюдалось статистически значимое снижение показателя относительно групп сравнения на фоне тимических препаратов, которое сохранялось до последнего дня эксперимента. Полученные в данной работе данные свидетельствуют об улучшении под влиянием пептидных лекарственных средств обучения и согласуются с результатами, полученными на фоне препарата полипептидов тимуса тактивина [18, 19]. После однократного интраназального введения МФТП (серия 2 экспериментов) у животных контрольной группы не удалось выработать УРАИ - животные не достигли критерия обученности - 80% правильных реакций. Максимальный уровень правильных реакций в контрольной группе составил 64%. В отличие от серии экспериментов 1 у животных 2-й серии наблюдали статистически значимые различия между контрольными и интактными животными (рис. 3, табл. 3). Введение пептидных препаратов позволило ускорить процесс обучения по сравнению с контрольной (во все дни выработки рефлекса) и интактной (в 4-й и 6-й дни выработки рефлекса) группами (см. рис. 3). Первая реакция избегания, 5 и 10 подряд на фоне тимических препаратов появляются раньше, чем у контрольной группы (см. табл. 3). Процесс выработки УРАИ у крыс, так же как и в норме (без введения МФТП) проходил значительно быстрее на фоне пептидных препаратов. Число условных реакций статистически значимо выше на фоне тимических препаратов. Начиная с первого дня обучения у животных на фоне тимических препаратов процент МСР статистически значимо (р<0,05) ниже, чем у животных контрольной группы (рис. 4). Наблюдалось статистически значимое снижение показателя относительно контрольной (с 1-го дня) и интактной (с 5-го дня) групп на фоне тимических препаратов, которое сохранялось до последнего дня эксперимента. Сравнение показателей динамики выработки УРАИ и межсигнальных реакций у животных в норме и в МФТП-индуцированной модели болезни Паркинсона выявило ускорение выработки УРАИ на фоне тимических пептидов, что выражалось в приближении уровня условных реакций у животных в МФТП-индуцированной модели к показателям животных в норме (без введения нейротоксина), получавших те же препараты. Следует также отметить, что в МФТП-индуцированной модели болезни Паркинсона у всех животных контрольной группы наблюдали нарушения двигательной активности (табл. 4). Такие нарушения отсутствовали у интактных животных и животных на фоне препаратов пептидов тимуса. Обсуждение В связи с развитием направления, изучающего взаимосвязь нервной и иммунной систем, в том числе и при нейродегенеративных заболеваниях, мы сочли целесообразным исследовать возможность коррекции пептидами тимуса внешних признаков болезни Паркинсона у крыс и влияние на выработку УРАИ в модели паркинсоноподобного синдрома. Введение пептидов тимуса в норме (без введения нейротоксина) в тесте УРАИ оказало более выраженный мнемотропный эффект, чем введение пептидов после действия нейротоксина, что проявилось в увеличении количества реакций избегания в первые дни выработки рефлекса (см. рис. 1 и рис. 3) и более быстрому достижению критерия обученности. Полученные во 2 серии результаты свидетельствуют, что предварительное введение пептидов тимуса способно частично нивелировать разрушительное воздействие МФТП, оказывая нейропротекторный эффект. В основе данного механизма действия, вероятно, лежат антиоксидантные свойства пептидных препаратов, уменьшающие окислительный стресс, вызванный МФТП, а также нейромодуляторные свойства, вероятно, уменьшающие выраженность нейровоспаления, которое возникает во время гибели нейронов. При изучении патогенеза нейродегенеративных заболеваний в последнее время все больше внимания уделяется воспалительным процессам и взаимодействию при этом иммунной и нервной систем [20]. Показано, что адаптивная иммунная система вовлечена в механизмы нейродегенаративных заболеваний, и получены убедительные доказательства того, что периферические иммунные клетки мигрируют в мозг больных болезнью Паркинсона [21]. Накапливающаяся информация о многочисленных нарушениях иммунных функций у пациентов, страдающих болезнью Паркинсона [22] и у животных в экспериментальных моделях паркинсонизма [23, 24], позволяет предположить, что иммунная система вовлечена в инициацию и/или развитие болезни Паркинсона. Для области поражения нервной ткани при болезни Паркинсона характерно развитие локального иммунного ответа, сопровождаемое инфильтрацией в поврежденный район различных типов иммунных клеток, главным образом, Т-лимфоцитов [25]. Мы предполагаем, что введение тимических пептидов в модели паркинсоноподобного синдрома активирует Т-регуляторные клетки тимуса. Т-регуляторные клетки способны мигрировать в область нейровоспаления и через прямое взаимодействие с локальной глией снижать нейровоспаление и, таким образом, оказывать нейропротекцию [26-28]. Показатели, полученные на фоне пептидов тимуса в МФТП-индуцированной модели болезни Паркинсона, схожи с данными, полученными в группах, но без введения МФТП. Полученные результаты позволяют предположить, что введение тималина и тимозина фракции 5 животным корректирует нарушения, вызванные однократным введением МФТП у животных и проявляет положительное влияние на процесс формирования УРАИ у крыс, которое проявляется на начальных этапах формирования памятного следа. Заключение и выводы Полученные результаты в данной работе показывают, что препараты пептидов тимуса (тимазин фракция 5 и тималин) помимо иммуномодулирующего действия оказывают выраженный корректирующий эффект на нарушения, вызванные введением нейротоксина МФТП, у крыс. В последнее время при изучении патогенеза нейродегенеративных заболеваний все больше внимания уделяется воспалительным процессам и взаимодействию при этом иммунной и нервной систем [20]. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение воспалительного звена болезни Паркинсона с целью разработки методов лечения этого заболевания, направленных на восстановление механизмов регуляции воспаления. Становится очевидным, что поиск новых подходов в формировании нейропротективной терапии болезни Паркинсона должен рассматриваться в качестве терапевтической мишени на интегральную нейро-глиально-сосудистую систему. В контексте выявленной роли нейровоспаления, как ключевого компонента нейродегенеративного процесса, это может означать, например, проведение противовоспалительной терапии, направленной на ингибирование активности микроглиоцитов и/или активацию регуляторного звена иммунной системы, либо активацию синтеза астроцитами ростовых факторов. Таким образом, на основании полученных данных: 1. Показано активирующее влияние пептидов тимуса на выработку условного рефлекса активного избегания у здоровых крыс, которое наиболее выражено проявляется на начальных этапах формирования памятного следа. 2. Моторные и когнитивные нарушения у крыс на модели паркинсоноподобного синдрома могут быть скорректированы препаратами полипептидов тимуса, что позволяет выработать условный рефлекс активного избегания у животных после воздействия нейротоксина.

About the authors

A. G Korolev

Lomonosov Moscow State University

Moscow 119991, Russian Federation

A. V Novoseletskaya

Lomonosov Moscow State University

Moscow 119991, Russian Federation

N. M Kiseleva

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

117997, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files