Параллельное сравнительное исследование метаболизма жирных кислот в эритроцитах и других тканях при экспериментальном сахарном диабете

Полный текст

По данным ВОЗ, на сегодняшний день в мире насчитывается 347 млн больных сахарным диабетом (СД). Все чаще СД встречается у детей в младшем школьном и препубертатном возрасте. Это оправдывает необходимость дальнейшего изучения механизмов развития данной патологии, поиска новых решений в диагностике, коррекции и лечении СД [1-3]. Широкое применение высококачественных препаратов инсулина и других сахароснижающих препаратов, существенно продлевающих жизнь больных, не обеспечивает полной компенсации нарушенного обмена веществ и не предотвращает развитие многочисленных осложнений, среди которых основное место занимают поражения сердечно-сосудистой системы [4-6]. Многочисленные исследования в этой области свидетельствуют о том, что повреждающее действие гипергликемии на сосудистую стенку опосредуется свободными радикалами. Имеющиеся в литературе данные, полученные при изучении процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояния антиоксидантной системы (АОС) у больных СД, очень противоречивы и касаются лишь некоторых показателей системы ПОЛ - АОС [7]. Многие вопросы, связанные с особенностями нарушения липидного обмена, в том числе обмена жирных кислот (ЖК) в эритроцитах, печени, сердечной мышце и коже у больных СД, остаются нерешенными. Цель настоящей работы - параллельное сравнительное исследование патогенетических механизмов нарушения метаболизма ЖК в эритроцитах и других ммоль/л 35i 30- 25- 20- 15- 10- 5- г-1- 0- Clinical medicine Контроль 3 7 14 21 28 35 Срок после инъекции стрептозотоцина, сут Рис. 1. Динамика концентрации глюкозы после введения стрептозотоцина крысам. тканях и развития окислительного стресса при СД в эксперименте. Материал и методы Эксперименты проведены на 80 крысах-самцах линии Вистар одной возрастной группы (10-14 мес) массой 210-250 г. СД вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения 2,5% раствора стрептозо- тоцина (производство фирмы Sigma) в дозе 60 мг на 1 кг массы тела животного на фоне 24-48-часового голодания. Кровь у животных брали до эксперимента, через 3; 7; 14; 21; 28 и 35 дней после введения стрептозотоцина. Контрольным животным вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Об активности процессов ПОЛ в плазме крови, в мембране эритроцитов и гомогенатах печени (ГП), сердечной мышцы и кожи судили по содержанию ТБК- активных продуктов и малонового диальдегида (МДА), для определения концентрации которых использовали метод K. Yagi [8]. Активность каталазы (Кт) в крови определяли по методу М. Королюк и соавт. [9]. Материалом для исследования ЖК служили эритроциты (Эр), гомогенаты мышц сердца, печени и кожи. Экстракцию липидов из гомогенатов проводили по методу J. Folch и соавт. [10], после чего осуществляли гидролиз и метилирование ЖК методом Kenichi Ichihara и Yumeto Fukubayashi [11]. Применяли метод газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрией TraceGCUltraITQ 900 (ThermoScientific, СшА, 2009). Прибор калибровали стандартными смесями метиловых эфиров ЖК фирмы Sigma (СшА). Обсчет и идентификацию пиков проводили с помощью программно-аппаратного комплекса «Analytica for Windows» с использованием IBM Pentium IV 1800. Программное обеспечение для обработки данных осуществлялось: Xcalibur (Thermo); спектральные библиотеки: Mainlib; Microsoft Excel 2010. Цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты Исследование уровня глюкозы в крови у крыс показало, что на 3-и сутки после введения стрептозотоцина концентрация глюкозы достоверно увеличилась в 3,2 раза, а в моче - в 5,7 раза по сравнению с контрольной группой животных. В течение последующих дней наблюдения количество глюкозы в крови крыс этой группы оставалось стабильно высоким (рис. 1). мкмоль/л 3,0 2,5 2,0- 1,5- 1 1.0- 0,5- 0- Контроль 3 7 14 21 28 35 Срок после инъекции стрептозотоцина, сут Рис. 2. Концентрация МДА в эритроцитах крыс (M ± SD). Параллельно с гипергликемией, гиперхолестерине- мией и гипертриглицеридемией в зависимости от длительности времени после введения стрептозотоцина [12] возрастала и концентрация МДА и других ТБК- активных продуктов во всех изучаемых нами тканях, достигая высоких значении на 28-е сутки после введения стрептозотоцина (рис. 2, 3). Повышение активности ТБК-активных метаболитов было особенно значимым в гомогенатах печени и сердечной ткани на 28-е сутки после введения стрептозо- тоцина (р < 0,05). Как видно на рис. 3, концентрация ТБК-активных веществ во всех изучаемых тканях на 28-е сутки введения стрептозотоцина возрастает более чем в 2 раза (в печени до 0,254 ± 0,012 нмоль/мг при 0,123 ± 0,001 нмоль/мг в контроле и в коже до 0,141 ± 0,002 нмоль/мг по сравнению с контрольным уровнем 0,062 ± 0,003 нмоль/мг). Наряду с увеличением интенсивности свободнорадикального окисления (СРО) липидов и нарушением структуры и свойств эритроцитарной мембраны при стрептозотоциновом диабете наблюдаются изменения в системе антиоксидантной защиты. Так, показано, что в крови у крыс выявлено повышение активности Кт (рис. 4). Возрастание активности Кт в эритроцитах можно назвать компенсаторной реакцией на увеличение интенсивности СРО при экспериментальном СД, в то время когда другие компоненты АОС оказываются значительно чувствительнее к усилению окислительных процессов в клетке, что проявляется снижением активнмоль/мг ткани 3.0-, □ В кожной ткани □ В ткани печени Щ В ткани сердца Контроль 3 7 14 21 28 Срок после инъекции стрептозотоцина, сут Рис. 3. Концентрация ТБК-активных продуктов в ткани кожи, печени и сердечной мышцы (M ± SD). Клиническая медицина мкмоль/л 3,0-, ности других исследованных нами ферментов-антиоксидантов (СОД, ГПО) [12]. Таблица 1 Уровень ЖК в гомогенатах сердечной мышцы и кожи у крыс на 7-10-й день после введения стрептозотоцина (в % от суммы ЖК; M ± SD) ЖК Гомогенаты сердца Гомогенаты кожи контроль опыт контроль опыт 20:5 (ЭПК)) 0,150 ± 0,068 0,250 ± 0,016 0,170 ± 0,020 0,219 ± 0,001 22:6 (ДГК) 2,716 ± 0,176 2,874 ± 0,292 0,853 ± 0,111 0,620 ± 0,010 18:2 (линолевая) 16,354 ± 0,237 20,890 ± 1,057* 34,742 ± 0,040 34,926 ± 0,680 20:3 (дигомо-у-линоленовая) 0,162 ± 0,026 0,195 ± 0,009 0,155 ± 0,001 0,118 ± 0,001 20:4 (арахидоновая) 17,980 ± 0,320 11,734 ± 0,891* 0,462 ± 0,021 0,206 ± 0,004 Е НЖК 42,172 ± 0,61 46,145 ± 1,166 28,918 ± 0,996 32,898 ± 2,030 Е ННЖК 57,828 ± 0,61 53,855 ± 1,166 71,082 ± 0,996 67,102 ± 2,030 НЖК/ННЖК 0,730 ± 0,018 0,858 ± 0,042 0,407 ± 0,020 0,491 ± 0,045 Ега3 3,279 ± 0,362 3,447 ± 0,123* 1,600 ± 0,025 1,427 ± 0,203 Ега6 34,496 ± 0,110 32,818 ± 2,916 35,358 ± 0,051 35,250 ± 0,667 Ега7 1,385 ± 0,305 1,213 ± 0,021 4,191 ± 0,005 3,099 ± 0,106* Ега9 18,507 ± 0,330 16,232 ± 1,045 29,804 ± 0,293 27,238 ± 1,065 Таблица 2 Уровень ЖК в эритроцитах и гомогенатах печеночной ткани у крыс со стрептозотоциновым диабетом (в % от суммы ЖК, M ± SD) ЖК Эритроциты Гомогенаты печени контроль опыт контроль опыт 20:5 (ЭПК) 1,003 ± 0,020 1,32 ± 0,03* 0,270 ± 0,047 0,532 ± 0,44* 22:6 (ДГК) 4,436 ± 0,511 4,75 ± 0,23* 4,84 ± 0,83 5,950 ± 0,080* 18:2 (линолевая) 14,221 ± 0,140 13,81 ± 0,49* 20,46 ± 0,25 21,26 ± 0,27* 20:3 (дигомо-у-линоленовая) 0,30 ± 0,02 0,75 ± 0,21* 0,38 ± 0,01 0,43 ± 0,09 20:4 (арахидоновая) 13,746 ± 0,479 11,09 ± 0,091* 19,27 ± 1,08 17,51 ± 0,96 Е НЖК 43,115 ± 1,830 49,98 ± 2,12 36,67 ± 2,31 39,94 ± 2,78 Е ННЖК 43,116 ± 1,910 54,36 ± 0,93 36,67 ± 0,93 39,91 ± 0,87 НЖК/ННЖК 1,010 0,91 1,0 1,0 Ега3 5,67 ± 0,41 6,28 ± 0,53* 5,49 ± 0,95 6,91 ± 0,05* Ега6 28,68 ± 1,35 25,94 ± 0,79* 34,88 ± 0,91 38,92 ± 0,66 Ега7 1,69 ± 0,05 1,23 ± 0,08* 1,85 ± 0,01 0,81 ± 0,06* Ега9 20,983 ± 1,330 12,19 ± 0,45 16,31 ± 0,93 13,38 ± 0,06 Примечание. * - различия достоверны по равнению с контрольной группой (p < 0,05); Е - сумма. Примечание. * - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (p < 0,05); НЖК - насыщенные ЖК; ННЖК - ненасыщенные ЖК; Е - сумма. Во всех группах было по 10 животных. При определении состава ЖК на 7-10-е сутки после введения стрептозотоцина (табл. 1) установлено, что в сердечной мышце и коже возрастает суммарное содержание НЖК за счет пальмитиновой, стеариновой и арахиновой ЖК. Коэффициент НЖК/ННЖК особенно значительно возрастает через 28 дней после введения препарата. В течение всего периода наблюдения отмечается снижение уровня га-7 и га-9 ЖК. Снижение уровня га-7 (пальмитиновой и пальмитоле- иновой кислот) свидетельствует о возрастании уровня триглицеридов (ТГ). При этом между пальмитиновой кислотой и ТГ отмечается прямая корреляция (г = +0,87), между уровнем глюкозы в крови и пальмитиновой кислоты отмечается также прямая корреляция (г = +0,63). Увеличение концентрации га-9 ЖК связано с увеличением содержания олейновой кислоты. Аналогичная картина отмечается и в других изучаемых нами тканях: на 28-й день наблюдения после введения препарата достоверно повышается уровень всех НЖК, особенно Контроль 3 7 14 21 28 35 Срок после инъекции стрептозотоцина, сут Рис. 4. Значение активности каталазы в крови у крыс (M ± SD). значительно возрастают концентрации миристиновой и пальмитиновой кислот. Снижение содержания полинена- сыщенных жирных кислот (ПННЖК) га-3 и га-7 в мышечной ткани сопровождается отрицательной корреляцией между уровнем холестерина и семейством ПННЖК га-3 (г = -0,56), а также между уровнем ТГ и ПННЖК га-3 (г = -0,61). В пуле НЖК максимальное повышение уровня отдельных фракций в эритроцитах (табл. 2) отмечается в опытной группе крыс на 7-е сутки после введения стрептозотоцина: миристиновой (С14:0) кислоты - на 56%, пальмитиновой (С16:0) - на 45,8%, стеариновой (С18:0) - на 24,8% по отношению к контрольной группе. Содержание мононасыщеннх жирных кислот (МНЖК) пальмитоолейновой и миристоолейновой было низким. Образование МНЖК из насыщенных катализируется 9-десатуразой. При ее гиперэкспрессии происходит возрастание уровня пальмитиновой кислоты относительно стеариновой. Свидетельством повышенной активности синтазы ЖК в эритроцитах в опытной группе может являться тот факт, что у крыс этой группы уровень пальмитиновой кислоты снижен на 15,7% (р < 0,05) в сравнении с контролем, а суммарное содержание стеариновой и арахиновой - на 38,3% (р < 0,05). В отличие от других НЖК уровень миристиновой кислоты в эритроцитах животных опытной группы не снижается, а наоборот, имеет тенденцию к росту (p = 0,2), по-видимому, в связи с тем, что миристиновая ЖК в основном включается в клеточные ТГ [6], что может привести к гипертриглицеридемии. Уровень олей- новой ЖК в Эр и ГП снижается в 1,72 ± 0,09 и 1,2 ± 0,03 раза соответственно (р < 0,05). Между тем как в Эр, так и в ГП крыс достоверно повышается уровень насыщенной пальмитиновой ЖК и снижается уровень МНЖК (за счет олейновой кислоты). Несмотря на то что концентрация ЭПК и ДГК достоверно повышается, при этом значительно снижается суммарное содержание га-3 ЖК за счет альфа-линолевой кислоты. Сумма га-6 жирных кислот достоверно снижается не только в Эр, но и в ГП. Суммарное содержание ЖК в семействе га-9 в Эр на 7-е сутки после введения стрептозотоцина также достоверно снижается. Таким образом, при СД в эксперименте уже в ранние сроки развития патологии наряду с гипертриглицериде- мией и гиперхолестеринемией отмечаются значительные изменения в жирнокислотном составе крови и в го- могенатах изучаемых тканей, что сопровождается ПОЛ и снижением активности ферментов-антиоксидантов, а также снижением степени утилизации глюкозы Эр. При экспериментальном СД повышение уровня насыщенной пальмитиновой ЖК приводит к снижению уровня МННЖК (за счет олейновой ЖК), что существенно отличается от соответствующего спектра у больных СД. Полученные результаты исследования убедительно свидетельствуют о том, что уже на ранних стадиях развития СД изменения в пуле ЖК эритроцитов и гомогенатов печени, кожи и сердечной мышцы аналогичные (с небольшими различиями) и что во всех изучаемых тканях нарушение метаболизма ЖК имеет атеросклеротическую направленность. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Clinical medicine Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Нина Погосовна Микаелян

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Email: ninmik@yandex.ru
профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии лечебного факультета ГОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» 117997, г. Москва

З. Х Нгуен

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, г. Москва

О. С Комаров

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, г. Москва

К. А Микаелян

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

117997, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы